一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用。


背景技术：

2.蜜蜂作为重要的经济昆虫，广泛分布于全世界，全世界蜂群的饲养量约7000万群，在农作物授粉方面发挥着重要作用，具有极高的经济和生态学价值。蜂产品，如蜂蜜、蜂王浆、蜂胶等，是维护人类健康不可多得的天然产品，创造了可观的社会和经济效益。
3.蜂群通常由两种性别的三种类型蜜蜂个体组成，即蜂王、工蜂和雄蜂，这三种类型蜜蜂，在蜜蜂学中统称为“三型蜂”。蜂群由两性蜂组成，既雌性蜜蜂和雄性蜜蜂。雌性蜜蜂由受精的二倍体卵发育形成，雄性蜜蜂由未受精的单倍体卵发育形成。雌性蜜蜂中又分化出两种级型，蜂王和工蜂。蜂王性器官发育完全，工蜂的性器官退化。蜜蜂级型的分化，是由后天的环境因素造成，主要是食物和发育的巢房的不同。
4.随着2006年科学家公布了蜜蜂基因组的测序结果，蜜蜂成为了继果蝇、按蚊、家蚕之后，第四种测定基因组序列的昆虫，蜜蜂研究正式进入了“后基因组”时代。蜜蜂已经发展成为社会性昆虫的模式生物，用以探究昆虫社会性、神经生理与行为以及级型分化等
5.级型分化是社会性昆虫的一个典型特征。具有相同遗传物质的二倍体蜜蜂幼虫，在幼虫期不同食物的影响下可分别发育成蜂王和工蜂，两者在形态和社会职能上都有着显著的区别。蜂群的三型蜂体色分化是级型分化的一种表现，然而，关于蜜蜂体色分化的研究鲜有报道。黑色素、眼色素和蝶呤类色素是构成昆虫体色及斑纹形成模式的三大内源性色素，西方蜜蜂体表的黄色较明显，与黄色物质形成直接相关的是蝶呤类色素合成途径，即bh4合成途径。
6.黑色素、眼色素和蝶啶类色素是构成昆虫体色及斑纹形成模式的三大内源性色素，其中蝶啶类色素是bh4从头合成途径中的代谢中间体，包括新蝶呤、墨蝶呤和生物蝶呤等。bh4合成代谢网络在双翅目模式生物黑腹果蝇和鳞翅目模式生物家蚕中都有较多的研究，但是在膜翅目昆虫中几乎没有研究报道。
7.蜂群中蜂王、雄峰、工蜂的体色分型明显，主要是黄体色分布有差异。而昆虫黄色色素的形成源自蝶呤类色素的合成与代谢途径，即bh4合成途径。飞蝗与蚜虫的体色分型多认为与温度有关，蜂群的体色分型的决定因素值得探究。
8.无论是作为细胞内生理代谢重要的辅因子，还是作为昆虫体色和斑纹形成模式的重要参与成员，蜜蜂bh4合成途径的研究都具有重要的意义。
9.蜜蜂基因组测序的完成及数据库建立后，以蜜蜂为社会性昆虫研究的模式生物，在基因组学、分子生物学和遗传学领域取得了大量的研究成果。基于基因组大数据，越来越多的新的功能基因被成功发掘、克隆并鉴定。对于蜜蜂bh4合成代谢网络的研究，首要工作当是克隆并鉴定参与bh4合成的关键酶。
10.bh4的合成中有一条重生途径，或称为回收途径，对于芳香族氨基酸的代谢具有十
分重要的意义：一、保证了还原性辅因子的连续供给；二、有效防止了有害的反应代谢中间物bh4‑
4α
‑
甲醇胺在体内的积累。当bh4作为辅酶参与芳香族氨基酸羟基化反应时，bh4上的单分子氧被转移至相应的氨基酸上，bh4进而被氧化为四氢生物蝶呤
‑
4α
‑
甲醇胺，bh4‑
4α
‑
甲醇胺也被称作4α
‑
羟基
‑
四氢生物蝶呤，两个酶参与了bh4氧化物的脱反应并重新还原生成bh4——蝶呤
‑
4α
‑
甲醇胺脱水酶(pterin
‑
4α
‑
carbinolamine dehydratase，pcd)和二氢喋啶还原酶，通过检测蜜蜂体内pcd的基因转录表达水平可以判断bh4的重生合成的代谢水平，为蜜蜂体内bh4合成量提供一定程度的预测与分析，为蜜蜂乃至膜翅目昆虫的体色差异和疾病防治提供一定的基础和参考。


技术实现要素：

11.针对现有技术不足，本发明提供一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，通过对蝶呤
‑4‑
α
‑
甲醇胺脱水酶pcd的检测建立蜜蜂中bh4合成量的相关参考指标，通过研究意大利蜜蜂群中各分化种类的蜜蜂的pcd的基因表达的水平，为意大利蜜蜂bh4合成途径提供理论基础，也为研究蜜蜂体内的色素代谢网络提供一定的参考。
12.为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
13.一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，所述检测方法为设计一组荧光定量引物进行检测，其引物序列为：
14.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
f：ctgtgcaacaagatagag；
15.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
r：cattaacatcgtgagaag。
16.优选的，所述检测方法包括以下步骤：
17.(1)荧光定量引物的设计：采用ncbi预测该基因信息，获得基因序列为seq id no.7，后对意大利蜜蜂中的蜂王、工蜂、雄蜂的pcd进行扩增，检测得序列为seq id no.8，以二者共同的部分为模板设计荧光定量引物得：
18.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
f：ctgtgcaacaagatagag；
19.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
r：cattaacatcgtgagaag；
20.(2)总rna的提取：采用任意一种通用的rna提取方法，从意大利蜜蜂成体中提取总rna，总rna序列如seq id no.9；
21.(3)cdna合成：以意大利蜜蜂总rna为模板合成cdna，反应体系为20μl；
22.(4)实时荧光pcr：以上述合成的cdna为模板，上述步骤(1)中amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
f和amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
r以及β
‑
actin
‑
f和β
‑
actin
‑
r为特异性引物，进行实时荧光pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值取平均数；
23.(5)意大利蜜蜂蝶呤
‑4‑
α
‑
甲醇胺脱水酶基因相对表达量的计算：实时荧光定量pcr后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，计算意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的表达差。
24.优选的，所述步骤(1)中选用以下引物序列进行pcd基因全长的扩增：
25.amel
‑
pcd
‑
like
‑
f：tatgtcgattcttacgcg；
26.amel
‑
pcd
‑
like
‑
r：ttttcttccattttagcaat。
27.优选的，所述步骤(4)中β
‑
actin
‑
f的序列为atgccaacactgtcctttctgg；β
‑
actin
‑
r的序列为gacccaccaatccatacgga。
28.优选的，所述操作中每条引物分别配制成浓度为100μm的贮存液，工作浓度为2μm。
29.优选的，所述步骤(5)中采用2
－δδct
法计算pcd基因的相对表达量，并比较差异。
30.本发明提供一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，与现有技术相比优点在于：
31.(1)本发明采用的实时荧光rt
‑
pcr技术，实时荧光pcr技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光pcr技术全封闭反应，无须pcr后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性，实时荧光rt
‑
pcr技术也免除了常规pcr中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
32.(2)在通过qrt
‑
pcr的方法研究意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的相对表达量，结果显示工蜂与蜂王体内pcd表达水平相近，雄蜂体内pcd的表达量则是前两者的三倍，这结果可能指示雄蜂体内bh4合成水平明显高于工蜂和蜂王。
33.(3)本发明研究结果可直接说明意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的表达水平差异，对探究不同意蜂体内的色素合成途径差异具有重要意义。
34.说明书附图
35.图1为ampcd扩增凝胶电泳图；
36.图2为pcd全长的测序结果对比图；
37.图3为意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的相对表达量。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例：
40.1、引物的获取：
41.(1)通过ncbi获得基因编号为loc411607的意大利蜜蜂蝶呤
‑4‑
α
‑
甲醇胺脱水酶mrna序列表(seq id no.7)；
42.(2)采用amel
‑
pcd
‑
like
‑
f：tatgtcgattcttacgcg；amel
‑
pcd
‑
like
‑
r：ttttcttccattttagcaat为引物，对意大利蜜蜂中的蜂王、工蜂、雄蜂的pcd进行扩增，后测序得ampcd测序结果(seq id no.8)
43.(3)比对seq id no.7和seq id no.8，采用两者共同的部分为模板设计荧光定量引物为
44.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
f：ctgtgcaacaagatagag；
45.amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
r：cattaacatcgtgagaag。
46.2、意大利蜜蜂总rna的提取:
47.选取3种(每组3个平行样)健康的意大利蜜蜂(工蜂、雄蜂和蜂王)进行测量不同意蜂pcd相对表达量的实验。分别选取不同品种的适量的健康意蜂，保存于
‑
20℃冷冻。
48.(1)取5头意蜂工蜂置于无菌研钵内，倒入液氮并迅速用研磨棒充分研磨，研磨后将粉末转入1.5ml中，再加1000μl rnaiso plus溶液入离心管，静置5min。
49.(2)将200μl氯仿加入离心管，剧烈振荡5
‑
10min，静置5min。
50.(3)4℃下12000rpm离心10min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入500μl异丙醇，轻柔颠倒混匀，放置10min，12000rpm离心10min。
51.(4)小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1000μl75％乙醇洗涤沉淀，4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。
52.(5)小心弃去上清液，室温干燥2min。将rna沉淀溶于50μldepc水中。
53.(6)所得沉淀即为意蜂总rna，产物立即使用或冷冻保存于
‑
80℃。
54.3、cdna的合成
55.以上述意大利蜜蜂总rna序列如(seq id no.9)作为模板，取一消毒的0.2ml离心管，加入以下反应体系(20μl体系)：
56.(1)在冰浴的nuclease
‑
free pcr管中加入以下试剂：rna按照800ng反转。
[0057][0058]
(2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。
[0059]
(3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
[0060]5×
rt buffer
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4.0ul
[0061]
thermo scientific ribolock rnase inhibitor(20u)
ꢀꢀꢀ
0.5ul
[0062]
revertaid premium reverse transcriptase(200u)
ꢀꢀꢀ
1.0ul
[0063]
(4)轻轻混匀后离心3～5s
[0064]
(5)在pcr仪上按照下列条件进行反转录反应
[0065]
①
25℃孵育
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10min
[0066]
②
cdna合成
ꢀꢀꢀꢀꢀ
50℃
ꢀꢀꢀꢀ
30min
[0067]
③
终止反应
ꢀꢀꢀꢀꢀ
85℃
ꢀꢀꢀꢀ
5min，处理后，置于冰上放置。
[0068]
(6)将上述溶液
‑
20℃保存。
[0069]
4、实时荧光pcr：运用sybr green嵌合荧光法进行rt
‑
pcr分析，使用abi step one plus仪器进行pcr反应，以上述合成的cdna为模板，使用amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
f：ctgtgcaacaagatagag、amel
‑
pcd
‑
qrt
‑
r：cattaacatcgtgagaag，和β
‑
actin
‑
f：atgccaacactgtcctttctgg、β
‑
actin
‑
r：gacccaccaatccatacgga为特异性引物，进行实时荧光pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数)取平均数。
[0070]
5、意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的相对表达量的计算：当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2
－δδct
法计算意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王pcd基因的表达差异。(结果如图3所示)
[0071]
从图3中看出，工蜂与蜂王体内的pcd表达水平相近，雄蜂体内pcd的表达量则是前两者的近三倍。
[0072]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0073]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。