一种基于IFA的BRV血清中和抗体效价水平的检测方法与流程

一种基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法，尤其涉及一种基于ifa的快速且准确检测brv血清中和抗体效价水平的方法。


背景技术：

2.牛轮状病毒(bovine rotavirus，brv)为呼肠孤病毒科轮状病毒属，无囊膜双链rna病毒，直径大约60～80纳米，是一个对称的二十面体，镜下观察可以看到典型的“车轮状”。该病毒引起的腹泻给奶牛养殖业带来巨大经济损失，表现在感染犊牛没有特效药、常引起很高的死亡率。
3.目前针对brv感染主要以病毒疫苗(例如专利文献cn110124027a公开的牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗)预防为主，其中在疫苗开发过程中需要筛选抗体阴性的实验动物，并对疫苗的免疫效力进行评价，用以评估疫苗的质量，因此这就需要对病毒血清中和抗体效价水平进行检测(中和抗体检测法)和进行免攻毒试验(免疫攻毒法)。然而，由于brv的接种传代需要依赖胰酶，但临床血清样本本身会对胰酶有中和作用从而会抑制brv在细胞中的生长并影响由brv诱导的细胞病变的产生(甚至不能产生细胞病变)，因此在brv血清中和抗体效价水平检测(例如血清中和试验、微量血清中和试验或elisa)中，难以准确检测出临床血清样本中brv中和抗体效价水平。另一方面，在brv疫苗效力检测中的中和抗体检测法和免疫攻毒法中都需要选用抗体阴性(即血清中和抗体效价≤1:4)的健康犊牛进行试验，由于brv对1
‑
7日龄犊牛最易感，选用抗体阴性的1
‑
7日龄犊牛作为实验动物是最佳的，然而在判断待选犊牛是否抗体阴性时，一般用细胞病变检测brv血清中和抗体效价水平的方法(例如血清中和试验)，该方法需要持续7天左右才能得到最终的结果，所以即便筛选到了brv血清中和抗体为阴性的健康犊牛(7日龄以内)，待将其用于实验时也亦超过了最佳时间，因此现有技术中常用7日龄以上(例如专利文献cn110124027a利用2月龄的健康犊牛)的健康犊牛作为实验动物。鉴于此，亟需一种快速且准确检测brv血清中和抗体效价水平的方法，用以指导brv疫苗的开发和生产。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明提供一种基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法，其包括以下步骤：
5.s1：制备系列二倍倍比稀释的待检血清样品；和
6.s2：分别将等体积的brv中和毒和步骤s1制备的系列二倍倍比稀释的待检血清样品的混合液接种ma104单层细胞，经固定液固定、加一抗、加二抗后进行荧光显微镜观察；
7.其中步骤s1中所述制备系列二倍倍比稀释的待检血清样品的操作为：使用含有136～144μg/ml胰酶的dmem维持液将临床血清样本按照2倍倍比稀释到1:16稀释度，之后再使用含有4～6μg/ml胰酶的dmem维持液按2倍倍比稀释。
8.上述检测方法中，步骤s2中所述ma104单层细胞铺在细胞板的孔中，且铺有ma104
单层细胞的细胞板的孔中预先添加有含有胰酶的dmem维持液。
9.上述检测方法中，在所述铺有ma104单层细胞的细胞板的孔中预先添加的含有胰酶的dmem维持液中胰酶的浓度为4～6μg/ml。
10.上述检测方法中，制备所述铺有ma104单层细胞的细胞板的操作具体为：把100～200μl的密度为1
×
105～3
×
105个/ml的ma104细胞悬液铺到多孔板的孔中，置于37
±
0.5℃，5％co2培养箱中培养，待细胞长成单层，使用含有4～6μg/ml胰酶的dmem维持液清洗细胞表层，随后每孔加入80～120μl，优选100μl含有4～6μg/ml胰酶的dmem维持液，获得所述铺有ma104单层细胞的细胞板。
11.上述检测方法中，步骤s2具体包括以下步骤：
12.(1)接种：分别将等体积的brv中和毒和步骤s1制备的系列二倍倍比稀释的待检血清样品在37
±
0.5℃下孵育55～65min，将孵育后的混合液分别接种到铺有ma104单层细胞的细胞板的孔中，再次培养46～50h，获得第一处理细胞板；
13.(2)固定液固定：用预冷的丙酮液作为固定液对步骤(1)中的第一处理细胞板的孔中细胞进行固定，获得第二处理细胞板；
14.(3)加一抗：向步骤(2)中的第二处理细胞板的孔中加入使用pbs按照1:800～1:1200比例稀释的brv标准阳性血清作为一抗，于37
±
0.5℃孵育55～65min后，弃掉，使用pbs进行清洗，获得第三处理细胞板；
15.(4)加二抗：向步骤(3)中的第三处理细胞板的孔中加入使用pbs按照1:800～1:1200比例稀释的羊抗鼠igg
‑
fitc作为二抗，于37
±
0.5℃孵育55～65min后，弃掉，使用pbs进行清洗，每孔再加入pbs避光保存，获得第四处理细胞板；
16.(5)荧光显微镜观察：在荧光倒置显微镜下观察步骤(4)获得的第四处理细胞板中的各孔，以孔中只有1～2个细胞出现特异性荧光的孔所对应的待检血清样品的稀释度作为brv血清中和抗体效价水平。
17.上述检测方法中，所述brv标准阳性血清为免疫牛轮状病毒灭活疫苗后的豚鼠血清。
18.上述检测方法中，步骤(1)中所述孵育后的混合液的接种量为每孔80～120μl，优选100μl。步骤(2)中所述固定液为预冷的80％丙酮液，所述固定液的加入量为每孔80～120μl，优选100μl；步骤(3)中所述一抗的加入量为每孔40～60μl，优选50μl；步骤(4)和所述二抗的加入量为每孔40～60μl，优选50μl。
19.上述检测方法中，所述brv中和毒的病毒滴度为200tcid
50
。
20.上述检测方法中，所述临床血清样本来源于以下中的一种或多种：牛、猪、家兔、豚鼠。
21.基于以上技术方案提供的基于ifa的brv血清中和抗体效价水平的检测方法在传统ifa法检测血清中和抗体效价水平的基础上结合brv的生长需要依赖胰酶的特点，采用两种含有不同浓度胰酶的dmem维持液对临床血清样本进行两阶段2倍倍比稀释制备得到用于和brv中和毒共孵育的待检血清样品，其中第一阶段为使用含有136～144μg/ml胰酶的dmem维持液将临床血清样本稀释到1:16稀释度，之后第二阶段的2倍倍比稀释(即1:16稀释度之后的2倍倍比稀释)为使用含有4～6μg/ml胰酶的dmem维持液进行稀释，通过两阶段的2倍倍比稀释得到系列二倍倍比稀释待检血清样品，可以有效提高待检血清样品中胰酶与血清的
相对比例，避免临床血清样本本身与胰酶的中和作用而产生的对brv在细胞中的生长的影响，进而提高检测brv血清中和抗体效价水平的准确性。另一方面，本发明提供的方法基于ifa(间接免疫荧光)检测原理，具有检测周期短、特异性强和检测结果容易辨别和客观(检测结果通过荧光显微镜观察)等特点，并且ifa是将brv活毒接种细胞，标记的是结构完整的全病毒颗粒，因此本发明提供的方法还具有快速(约2天左右即可获得检测结果)和更具有代表性的优势，可以用于筛选出7日龄以内的抗体阴性健康易感犊牛，以用作brv疫苗效力评价中的抗体阴性实验动物。
22.综上所述，本发明提供的方法可以有效对brv疫苗的免疫效力进行准确、快速评价，并且可以为brv疫苗效力评价中的中和抗体检测试验和免疫攻毒试验提供7日龄以内的抗体阴性健康易感犊牛作为实验动物，对于brv疫苗生产和疫苗质量监控具有重要意义。
附图说明
23.图1为鉴别brv的pcr产物的凝胶电泳图像；
24.图2为试验组和对照组临床血清样本不同稀释度下的荧光显微镜下观察图像；
25.图3为免疫牛轮状病毒灭活疫苗后的豚鼠血清按照1:1000稀释后作为一抗，兔抗豚鼠igg
‑
fitc荧光抗体按照1:1000稀释后作为二抗的荧光显微镜下观察图像；
26.图4为临床血清样本不同稀释度下和不同培养时间下的荧光显微镜下观察图像。
具体实施方式
27.由于临床血清样本本身会对胰酶产生中和作用，因此会影响现有的brv血清中和抗体效价水平检测方法(例如血清中和试验)中其生长需要依赖胰酶的brv在细胞中的生长，进而会影响brv所诱导的细胞病变，从而导致brv血清中和抗体效价水平检测结果不准确；另外现有的brv血清中和抗体效价水平检测方法(例如血清中和试验)耗时较长(一般约为7天)以至于不能及时筛选出抗体阴性的7日龄以内的健康易感犊牛。针对以上这些问题，本发明提供一种基于间接免疫荧光(ifa)原理的brv血清中和抗体效价水平检测方法，该方法在现有ifa法检测血清中和抗体效价水平(ifa法检测血清中和抗体效价水平的步骤通常包括将等体积的病毒液和待检血清样品经孵育后接种细胞、固定液固定、加一抗、加二抗和荧光显微镜观察等步骤，例如专利文献cn112362880a、cn112630443a等公开的ifa法检测血清中和抗体的方法)的基础上结合brv的生长需要依赖胰酶的特点，利用两种含有不同浓度胰酶的dmem维持液对临床血清样本进行两阶段倍比(例如2倍比)稀释获得待检血清样品，能够有效避免临床血清样本本身对胰酶的中和作用及其对检测结果的影响，从而可以准确检测出brv血清中和抗体效价水平。另一方面，本发明提供的方法还具有周期短的特点(2天左右即可获得检测结果)，因此可以及时筛选出抗体阴性的7日龄以内的健康易感犊牛，以用作brv疫苗效力检测时的抗体阴性实验动物。还有，本发明提供的方法检测结果通过荧光显微镜观察获得，相对于通过观察细胞病变的方法更加客观准确，并且由于ifa检测所需时间较短，又可以进一步减小临床血清样本本身对胰酶的中和作用而产生的对brv在细胞中的生长的影响，与采用的两阶段倍比稀释制备待检血清样品的技术手段共同提高检测结果的准确性。
28.通过以下具体实施例详细说明本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行
实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
29.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
30.以下实施例中使用的引物通过已有技术合成。
31.实施例1：brv病毒采集、鉴定和培养
32.1.1、从内蒙古呼和浩特市采集可疑感染brv的犊牛的排泄物，使用1ml pbs反复溶解后，反复冻融三次，3000r/min，离心10min后取上清液作为病毒样本，使用核酸提取试剂盒(天根)，提取病毒样本中的双链rna，接下来将rna反转录为cdna，利用dnaman设计的brv目的基因引物(扩增的目的条带长度应为1062bp)对该cdna进行鉴定。其中brv目的基因引物序列为：
33.brv
‑
f：5’ggctttaattgcgagaatttcc 3’(seq id no:1)；
34.brv
‑
r：5’ggtctcatcattcaactctaat 3’(seq id no:2)；
35.1.2、利用上述引物以反转录后的cdna为模板进行pcr扩增，具体的扩增体系为：2μl模板，0.5μl brv上游引物(brv
‑
f)，0.5μl brv下游引物(brv
‑
r)，extap酶13μl，ddh2o为9μl；pcr循环条件是：94℃预变性4min，然后94℃45s、55℃45s、72℃30s共30个循环，最后72℃延伸10min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1所示，其中泳道2为病毒样本中提取的rna反转录获得的cdna模板，泳道3、4和5为阴性对照。
36.由图1所示结果可见，泳道2的目的条带为约1000bp，并且将目的条带进行胶回收，测序结果显示与brv序列一致且长度为1062bp，证明采集获得的病毒样本中含有brv病毒。
37.1.3、将检测结果为brv阳性的病毒样本通过0.22μm滤膜过滤后，按照1ml剂量接种于ma104细胞，待细胞病变达到80％后，收获病毒液，按照相同的方法连续传代，直到发现ma104细胞出现典型的病变(病变后细胞皱缩变圆，细胞边界不清晰，呈现典型的椰菜花样形态，最后病变细胞完全脱落)，待细胞病变达到80％后，收获病毒液，即为brv病毒液。
38.实施例2：brv中和毒的制备
39.2.1、将ma104单层细胞(金宇保灵生物药品有限公司实验室保存，可商购获得)通过消化和传代的方法制备成为2
×
105个/ml细胞悬液，按照150μl细胞悬液铺在96孔板的孔中，于37℃，5％co2培养箱中培养24h，待细胞长成单层后，使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液(gibco公司)清洗细胞表层后，每孔再次加入含有5μg/ml胰酶的dmem维持液100μl，获得铺有ma104单层细胞的细胞板。
40.2.2、将实施例1获得的brv病毒液使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液进行10倍连续稀释，从10
‑1～10
‑8将每个稀释滴度的病毒液接种于上述步骤2.1的处理好的单层细胞板的孔中，每孔加入100μl病毒液，作为试验孔；同时设立细胞对照孔，对照孔加入含有5μg/ml胰酶dmem维持液，但不加入brv病毒液。试验孔和对照孔细胞均于37℃，5％co2培养箱中培养7天，观察并记录试验孔和对照孔中细胞病变情况，结果如下表1所示，按照reed
‑
muench计算brv的tcid
50
。
41.表1.试验孔和对照孔中细胞病变情况统计结果
[0042][0043]
根据上表1所示的试验孔和对照孔中细胞病变情况按照reed
‑
muench计算brv的tcid
50
，计算方法如下所示：
[0044]
距离比＝(高于50％的百分数
‑
50％)/(高于50％的百分数
‑
低于50％的百分数)即：(75
‑
50)/(75
‑
0)＝0.333
[0045]
lg tcid
50
＝距离比
×
稀释度对数之间的差 高于50％病变率的稀释度的对数＝0.333
×
(
‑
1) (
‑
7)＝
‑
7.33，通过上述结果可知该brv病毒的最终tcid
50
＝10
‑
7.33
/0.1ml＝10
‑
8.33
/ml，作为brv病毒原液，即0.1ml病毒原液中含有10
7.33
个tcid
50
，也即10
7.33
tcid
50
/0.1ml。
[0046]
200tcid
50
中和毒(ifa法检测血清中和抗体效价水平时常规使用的中和毒滴度)的制备：
[0047]
为了制备200ml的200tcid
50
中和毒液，可以将brv病毒原液稀释105倍后取187ul ml加入200ml维持液中，即可获得。
[0048]
实施例3：brv的ifa中和抗体检测方法中的中和反应条件的确定
[0049]
3.1、临床血清样本稀释时维持液中胰酶浓度的确定
[0050]
分别使用含有20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml，140μg/ml，160μg/ml，180μg/ml胰酶的dmem维持液对brv中和抗体阴性血清样本(gibco胎牛血清)进行连续2倍倍比稀释至1:128稀释度，获得由含有不同浓度胰酶的dmem维持液稀释得到的系列稀释度的血清样品。将每个稀释度的血清样品与等量的200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)中和1h后，将中和后的混合液100μl接种到铺有ma104单层细胞的细胞板(实施例2中步骤2.1制备)的孔中，同时设立正常接毒细胞对照，再次培养5
‑
7天后。观察细胞病变及其细胞拉网(由于胰酶浓度不断升高而引起的区别于细胞病变的细胞损伤)情况，结果如下表2所示。
[0051]
表2：不同胰酶浓度与细胞病变滴度和细胞拉网滴度之间的关系
[0052]
[0053]
由上表2结果可以看到，使用140μg/ml胰酶浓度的dmem维持液稀释血清样本后，细胞病变滴度维持在1:8，而且后期随着胰酶含量增加，细胞的病变滴度不再发生变化，因此可以看出140μg/ml胰酶浓度的加入量已经达到了能使细胞发生病变的极限值，而且该浓度条件下，细胞拉网滴度最小是在1:32，说明1:32稀释度情况下胰酶浓度已经超过了细胞承受的极限值，因此将血清样本连续2倍倍比稀释到1:16稀释度选择140μg/ml胰酶浓度为适宜浓度，其在起到中和血清样品从而消除血清样品对brv生长影响的同时，还不会损伤细胞(即不会引起细胞拉网情况)。而160μg/ml和180μg/ml的胰酶浓度已经明显超过能使细胞发生病变的极限值，会导致细胞由于胰酶浓度过高而引起损伤(出现细胞拉网情况)，而120μg/ml及以下的胰酶浓度明显还没有达到能使细胞发生病变的极限值，即还不能完全消除由于血清样本本身对胰酶的中和作用而导致的brv的生长影响。
[0054]
在同一项实验中，还分别使用含有135μg/ml，136μg/ml，137μg/ml，138μg/ml，139μg/ml，141μg/ml，142μg/ml，143μg/ml，144μg/ml，145μg/ml胰酶的dmem维持液对brv中和抗体阴性血清样本进行连续2倍倍比稀释，以观察不同胰酶浓度与细胞病变滴度和细胞拉网滴度之间的关系。结果观察到利用含有以上136μg/ml，137μg/ml，138μg/ml，139μg/ml，141μg/ml，142μg/ml，143μg/ml，144μg/ml胰酶的dmem维持液将血清样本连续2倍倍比稀释到1:16稀释度时，也均可以在有效消除血清样品对brv生长影响的同时而不会明显损伤细胞(病变滴度均维持在1:8，细胞拉网滴度均维持在1:32)。因此本发明提供的方法中将血清样本连续2倍倍比稀释到1:16稀释度时确定使用含有136～144μg/ml胰酶的dmem维持液。
[0055]
3.2、1:16稀释度之后对血清样品稀释的胰酶浓度确定
[0056]
分别使用含有5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml胰酶的dmem维持液对3.1中使用含有140μg/ml胰酶的dmem维持液稀释为1:16稀释度的血清样品进行连续2倍倍比稀释至1:256稀释度，获得系列稀释度血清样品。分别将各稀释度血清样品与等量的200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)中和1h后，将中和后的混合液100μl接种到铺有ma104单层细胞的细胞板(实施例2中步骤2.1制备)的孔中，同时设立正常接毒细胞对照，再次培养5
‑
7天。观察细胞病变及其细胞拉网情况，结果如下表3所示。
[0057]
表3：不同胰酶浓度与细胞病变滴度和细胞拉网滴度之间的关系
[0058][0059]
由上表3结果可以看到，使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液接着将3.1中已稀释至1:16稀释度的血清样品继续进行稀释后，细胞一直未出现细胞拉网的情况，而分别使用含有10μg/ml和15μg/ml胰酶的dmem维持液进行稀释时，分别在1:128和1:64滴度时出现细胞拉网的情况，因此选择含有5μg/ml胰酶的dmem维持液对已稀释至1:16稀释度之后的血清样品进行连续2倍倍比稀释，不会出现细胞拉网情况。
[0060]
在同一项实验中，还分别使用含有4μg/ml，4.5μg/ml，5.5μg/ml，6μg/ml胰酶的dmem维持液对brv中和抗体阴性血清样本进行连续2倍倍比稀释，以观察不同胰酶浓度与细胞病变滴度和细胞拉网滴度之间的关系。结果观察到利用含有以上胰酶浓度(4μg/ml，4.5μg/ml，5.5μg/ml，6μg/ml)的dmem维持液将1:16稀释度的血清样品继续进行连续2倍倍比稀
释至1:256稀释度时，细胞病变滴度均为1:256，并且细胞均未出现细胞拉网的情况。因此本发明提供的方法中将1:16稀释度血清样品继续进行连续2倍倍比稀释时确定使用含有4～6μg/ml胰酶的dmem维持液。
[0061]
综上所述，在本发明的基于ifa的brv血清中和抗体效价水平检测方法中对临床血清样本进行稀释时，为了避免血清样本本身对胰酶的中和作用而对检测结果造成影响，首先使用含有136～144μg/ml胰酶的dmem维持液将临床血清样本稀释到1:16，之后的系列2倍倍比稀释度(例如2倍倍比稀释至1:256稀释度)使用含有4～6μg/m胰酶的dmem维持液进行稀释，分别获得各稀释度条件下的待检测血清样品。
[0062]
3.3、brv的ifa中和抗体检测方法中作为一抗的brv阳性血清和作为二抗的兔抗豚鼠igg
‑
fitc的工作浓度确定
[0063]
(1)按照实施例2步骤2.1制备获得铺有ma104单层细胞的细胞板。首先使用含有140μg/ml胰酶的dmem维持液将临床血清样本(gibco brv阴性胎牛血清)稀释到1:16稀释度，之后使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液将已稀释好1:16稀释度血清样品稀释到1:256，将各稀释度的血清样品与等体积200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)进行中和，37℃孵育1h后，将中和后的液体100μl接种到铺有ma104单层细胞的细胞板的孔中，同时设立正常接毒细胞对照和空白对照，再次培养48h。
[0064]
(2)用预冷的含有80％丙酮液对试验组、对照组和空白对照组的细胞进行固定，每孔100μl，4℃放置1h后，弃掉固定液，风干后，使用pbs清洗细胞表面，弃掉pbs液。
[0065]
(3)抗brv阳性血清(免疫牛轮状病毒灭活疫苗后的豚鼠血清，其中牛轮状病毒灭活疫苗使用实施例1获得brv病毒液按照cn110124027a公开的牛轮状病毒灭活疫苗的制备方法制备)作为一抗，使用pbs分别按照1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000和1:2000进行连续倍比稀释，分别向步骤(2)经固定液固定的孔中按每孔50μl加入一抗，于37℃孵育1h后，弃掉，使用pbs进行清洗，每孔加入250μl，放置5min后，拍干，重复清洗3次。
[0066]
(4)羊抗鼠igg
‑
fitc(艾博抗山羊抗豚鼠igg h&l(alexa flour 488))作为二抗，使用pbs分别按照1:100、1:200、1:500、1:1000和1:2000进行连续倍比稀释，分别向步骤(3)已加入一抗的每孔加入50μl，于37℃孵育1h后，弃掉，使用pbs进行清洗，每孔加入250μl，放置5min后，拍干，重复清洗5次后，每孔再加入50μl pbs避光保存，在荧光倒置显微镜下进行观察。
[0067]
结果如图2所示，可见免疫后的豚鼠血清按照1:1000进行稀释后作为一抗，兔抗豚鼠igg
‑
fitc荧光抗体按照1:1000进行稀释后作为二抗，荧光显微镜下观察(为1:8稀释度时荧光观察结果)，荧光显色效果较好。在同一项实验中，还使用按照1:800和1:1200进行稀释的免疫后的豚鼠血清作为一抗，以及按照1:800和1:1200进行稀释的兔抗豚鼠igg
‑
fitc荧光抗体作为二抗，荧光显微镜观察结果表明，均可以获得荧光显色效果较好的结果。因此，本发明提供的方法中，使用按照1:800～1:1200进行稀释的免疫后的豚鼠血清作为一抗，以及按照1:800～1:1200进行稀释的兔抗豚鼠igg
‑
fitc荧光抗体作为二抗。
[0068]
3.4、brv的ifa中和抗体检测方法中细胞培养时间的确定
[0069]
(1)按照实施例2步骤2.1制备获得铺有ma104单层细胞的细胞板。将等体积的200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)和稀释后的血清样品(1:2、1:4和1:8稀释度)在37℃孵育1h后，将中和后的液体100μl接种到铺有ma104单层细胞的细胞板的孔中，同时设立正常
接毒细胞对照和空白对照，于37℃，5％co2培养箱中培养24h、48h、72h后，按照上述3.3中步骤(2)、(3)和(4)逐一取出细胞板进行固定、加入一抗和二抗，在荧光倒置显微镜下进行观察。
[0070]
结果如图3所示，可见24h培养时间的荧光较少，影响判定结果。48h培养时间荧光非常明显，而且细胞处理后几乎不脱落，72h培养时间的细胞中荧光虽然非常多，但是经过荧光染色过程处理后，细胞脱落较多，所以选定48h作为免疫荧光的适宜培养时间。在同一项实验中，还于37℃，5％co2培养箱中培养46h、47h、49h和50h，结果均实现与培养48h类似的效果，即荧光倒置显微镜观察时荧光非常明显，且细胞处理后几乎不脱落。因此本发明提供的方法中对接种brv和血清样品的中和液之后的细胞培养时间确定为46～50h。
[0071]
实施例4：基于ifa的brv血清中和抗体效价水平检测方法的建立
[0072]
该实施例建立的基于ifa的brv血清中和抗体效价水平检测方法旨在检测brv血清中和抗体效价水平，该方法可以检测任何种属来源的临床血清样本中的brv中和抗体效价水平，例如牛血清、猪血清、家兔血清、豚鼠血清、人血清等，以下步骤中以牛临床血清样本(gibco brv阴性胎牛血清)为例，具体包括以下步骤。
[0073]
(1)按照实施例2步骤2.1制备获得铺有ma104单层细胞的细胞板。将等体积的200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)和各稀释度条件下的待检测血清样品(按照实施例3的稀释方法获得，稀释至1:256稀释度，称为试验组)，或者将等体积200tcid
50 brv中和毒(实施例2制备)和各稀释度条件下的对照待检血清样品(使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液将牛临床血清样本连续2倍倍比稀释至1:256稀释度，称为对照组)37℃孵育1h后，将中和后的混合液100μl接种到铺有ma104单层细胞的细胞板的孔中，同时设立正常接毒细胞对照和空白对照，再次培养48h。
[0074]
(2)用预冷的含有80％丙酮液对试验组、对照组和空白对照组的细胞进行固定，每孔100μl，4℃放置1h后，弃掉固定液，风干后，使用pbs清洗细胞表面，弃掉pbs液。
[0075]
(3)抗brv阳性血清作为一抗，使用pbs按照1:1000稀释，向步骤(2)经固定液固定的孔中按每孔50μl加入一抗，于37℃孵育1h后，弃掉，使用pbs进行清洗，每孔加入250μl，放置5min后，拍干，重复清洗3次。
[0076]
(4)羊抗鼠igg
‑
fitc作为二抗，使用pbs按照1:1000稀释，向步骤(3)的每孔加入50μl，于37℃孵育1h后，弃掉，使用pbs进行清洗，每孔加入250μl，放置5min后，拍干，重复清洗5次后，每孔再加入50μl pbs避光保存，在荧光倒置显微镜下进行观察，结果如图4所示。
[0077]
ifa结果判定：当临床血清样本不含有brv中和抗体时，与任何稀释度的待检测血清样品共孵育的brv中和毒均不会被中和，进而brv可以感染ma104细胞的细胞核或细胞浆，在荧光倒置显微镜下会出现特异性荧光(绿色)，则临床血清样本为阴性，通常情况下(中和毒滴度为200tcid
50
)，当血清样本在1:2稀释度下出现特异性荧光时，则认为是阴性血清样本；而当临床血清样本中含有brv中和抗体时，与待检测血清样品共孵育的brv中和毒会被其中的brv中和抗体中和，并且随着稀释倍数的降低，被中和的brv就越多，能够感染ma104细胞的细胞核或细胞浆的brv就越少，在荧光倒置显微镜下出现的特异性荧光数量也就越少，当只有1～2个细胞出现特异性荧光或者恰好不出现特异性荧光时，此时被认为是该稀释度下待检测血清样品中含有的brv中和抗体量恰好能与brv中和毒中的brv病毒中和，便可以检测出临床血清样本中的brv中和抗体效价水平，并且当brv中和毒的滴度为200tcid
50
时，可以认为在荧光倒置显微镜下观察到当只有1～2个细胞出现特异性荧光或者恰好不出现特异性荧光所对应的孔的待检测血清样品的稀释度值即为临床血清样本的中和抗体效价值；而当临床血清样本中的brv中和抗体含量足够高时，会导致brv中和毒中的所有brv病毒被中和，进而不能使brv感染ma104细胞的细胞核或细胞浆，因此在荧光倒置显微镜下不会出现特异性荧光。
[0078]
根据图4，其中a幅表示对照组的荧光倒置显微镜下的观察结果，b幅表示试验组的荧光倒置显微镜下的观察结果。在已知检测的临床血清样本为brv阴性胎牛血清的情况下，可见对照组的临床血清样本在稀释度为1:16时依然未出现大量的荧光，临床血清样本中brv中和抗体水平检测结果明显偏高(这是由于brv的生长受到抑制所导致)；而试验组的临床血清样本在稀释度为1:2时，孔中只有2个细胞出现荧光，而下一个稀释度(1:4)荧光数量明显出现激增现象，并且随着稀释倍数越来越大后，有荧光的细胞越来越多，表明试验组的检测结果为临床样本阴性，这与实际情况相符，证明本发明方法检测结果准确可靠。因此相对于对照组的临床血清样本的稀释方法，试验组中临床血清样本的稀释方法能够避免临床血清样本本身对胰酶的中和作用而对brv的生长产生抑制，最终导致血清样本中brv中和抗体水平检测结果明显偏高的问题，证明本发明提供的方法对brv血清中和抗体水平的检测更加准确可靠，并且本发明提供的方法可以快速检测出brv抗体阴性的血清样本，可以为brv疫苗效力检测提供理想的7日龄以内的brv抗体阴性的健康易感犊牛。
[0079]
实施例5：基于ifa的brv血清中和抗体效价水平检测方法的实际应用
[0080]
该实施例以免疫牛轮状病毒灭活疫苗(利用实施例1制备获得的brv病毒液按照cn110124027a公开的牛轮状病毒灭活疫苗的制备方法制备，免疫方式为：颈部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血测定中和抗体水平)的健康犊牛的血清样本为例，说明本发明提供的基于ifa的brv血清中和抗体效价水平检测方法在对牛轮状病毒疫苗的免疫效力检测中的应用，具体操作如实施例4中所述，其中试验组的待检测血清样品为按照实施例3的稀释方法获得，稀释至1:256稀释度；对照组待检测血清样品为使用含有5μg/ml胰酶的dmem维持液将血清样本连续2倍倍比稀释至1:256稀释度获得。
[0081]
试验组和对照组的荧光显微镜观察结果表明，试验组检测获得的血清样本的brv中和抗体效价为1:32，而对照组检测获得的血清样本的brv中和抗体效价≥1:64，显然对照组方法检测的血清样本brv中和抗体效价结果普遍偏高，这是由于血清样本本身对胰酶具有中和作用而对brv的生长产生抑制的结果，这种结果在brv疫苗的免疫效力评价中会导致高估brv的免疫效力，对疫苗生产中的质量监控以及疫苗实际应用不利，可能存在免疫保护效果不佳而不能有效防控疫情的潜在风险。
[0082]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。