一种无载体纳米诊疗剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种无载体纳米诊疗剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症是危害人类健康的重大疾病，癌症的早期诊断和及时治疗是提高患者治愈率的有效途径。在肿瘤成像方面，近红外荧光成像（nirf）技术因其具备高灵敏、非侵入、实时性、背景噪声低、多色分析等优势，在肿瘤诊断中发挥着重要作用。磁共振成像（mri）是目前癌症早期诊断最有效的医学诊断手段之一，由于肿瘤组织和正常组织之间表现出来的差异较小，常采用gd
3
等造影剂增强mri图像对比度，以提高诊断效率。在肿瘤治疗方面，多数癌症通过单一手术治疗无法根治，需要化疗、放疗、光热治疗等辅助根除机体内残余的癌细胞，从而提高外科手术的治愈率。研究表明，将近红外光热疗联合化疗，可显著提高化疗药物的细胞毒作用，实现光热/化疗的协同作用。
3.但是，目前临床使用的诊疗试剂常因水溶性、靶向性、稳定性较差以及多药耐药性等问题限制了它们的诊疗效果。因此，科学家提出了纳米诊疗一体化，运用纳米载体将诊断和治疗试剂同时靶向输送到肿瘤部位，将诊断与治疗有机结合，实现肿瘤的个性化诊疗。然而，纳米药物载体虽然提高了药物的生物利用度和靶向性，但载体本身的生物毒性和体内代谢机制不明等问题大大限制了其应用。
4.利用具有功能的金属离子与诊疗剂中n、o、s等元素之间的强配位作用，构建无载体纳米诊疗剂，具有易于合成、尺寸可控、载药量高、功能多样且可调等优点，同时可避免载体引入导致的安全问题及对人体产生的额外代谢负担等。本发明选用具有nirf成像功能的光热剂及顺铂前药为配体，以具有mri成像功能的gd
3
为金属离子，通过金属
‑
有机分子的配位自组装及表面修饰制备无载体纳米诊疗剂，实现nirf/mri多模成像及光热/化疗协同抗肿瘤作用。


技术实现要素：

5.针对现有技术所存在的问题和需求，本发明的目的在于提供一种无载体纳米诊疗剂及其制备方法和应用，该纳米诊疗剂可主动靶向肿瘤组织，实现nirf/mri多模成像及光热/化疗协同抗肿瘤作用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种无载体纳米诊疗剂，所述无载体纳米诊疗剂由六水合醋酸钆、顺铂前药和光热剂制得的纳米自组装体和靶向分子构成；其制备方法包括以下步骤：
①
将六水合醋酸钆、顺铂前药和光热剂依次加入二甲基甲酰胺/乙醇（dmf/etoh）（v:v=5:3）溶液中，再向混合液中加入聚乙烯吡咯烷酮（pvp），混合溶液中pvp终浓度为23mg/ml，于反应釜中反应2
‑
12h，反应温度为80
‑
260℃，离心收集沉淀，并用无水乙醇清洗，
获得纳米自组装体；
②
将步骤
①
得到的纳米自组装体和靶向分子分别溶解于hepes溶液，再将靶向分子溶液加入纳米自组装体溶液中，室温反应1
‑
24h，离心收集沉淀，并用hepes溶液清洗，离心收集沉淀即得无载体纳米诊疗剂。
7.其中，上述顺铂前药为羧基化顺铂衍生物pt(iv)
‑
sa；上述光热剂为羧基化ir
‑
780、ir
‑
825、cypate中的任意一种；上述靶向分子为透明质酸、抗体、核酸适配体、转铁蛋白、rgd多肽中的任意一种；上述六水合醋酸钆、顺铂前药和光热剂的摩尔比为1:0.1
‑
1:0.05
‑
1；上述纳米自组装体与靶向分子的质量比为1:0.5
‑
10；上述hepes溶液的ph为7.4。
8.上述一种无载体纳米诊疗剂在制备肿瘤诊疗剂中的应用。
9.与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）本发明所制备的无载体纳米诊疗剂可主动靶向肿瘤组织，提高化疗药物和光热剂在肿瘤细胞的蓄积；（2）在肿瘤微环境中，本发明所制备的纳米诊疗剂可还原响应性和近红外光响应性释放药物，实现nirf/mri成像引导的光热/化疗协同抗肿瘤作用。
附图说明
10.图1为本发明实施例2制备的ncps的扫描电子显微镜结果。
11.图2为本发明实施例4制备的ncps
‑
ha的体外释放结果。
12.图3为本发明实施例4制备的ncps
‑
ha的细胞摄取结果。
13.图4为本发明实施例4制备的ncps
‑
ha对a549荷瘤裸鼠抑瘤实验的结果。
具体实施方式
14.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.实施例1：纳米诊疗剂（ncps）的制备方法将30mg六水合醋酸钆（gd(hac)3·
6h2o）、10mg pt(iv)
‑
sa和10mg cypate依次加入至15ml dmf/etoh（v:v=5:3）混合溶液中，再加入350 mg pvp，将混合溶液置于反应釜中，120℃反应4h，离心（12000r/min，10min）收集沉淀，并用无水乙醇清洗4次，离心收集（12000r/min，10min）沉淀，即得ncps。
16.实施例2：ncps的制备方法将30mg 六水合醋酸钆（gd(hac)3·
6h2o）、18mg pt(iv)
‑
sa和5mg cypate依次加入至15ml dmf/etoh（v:v=5:3）混合溶液中，再加入350mg pvp，将混合溶液置于反应釜中，140℃反应4h，离心（12000r/min，10min）收集沉淀，并用无水乙醇清洗4次，离心（12000r/min，10min）收集沉淀，即得ncps。
17.实施例2制备的ncps的扫描电子显微镜结果如图1所示：ncps为球形，分散均匀，粒径约90
‑
135nm。
18.实施例3：透明质酸靶向修饰纳米诊疗剂（ncps
‑
ha）的制备方法将10mg实施例2制备的ncps和10mg 透明质酸（ha）分别溶于hepes溶液（20mm, ph=7.4），配置后ncps溶液与ha溶液浓度均为1mg/ml，然后将ha溶液加入至ncps溶液中，室温避光反应12h，离心（12000r/min，10min）收集沉淀，并用hepes溶液（20 mm，ph =7.4）溶液清洗3次，离心收集沉淀得到ncps
‑
ha。
19.实施例4：ncps
‑
ha的制备方法将10mg实施例2制备的ncps和20mg ha分别溶于hepes溶液（20mm，ph=7.4），配置后ncps溶液与ha溶液浓度分别为0.5mg/ml和1mg/ml，然后将ha溶液加入至ncps溶液中，室温避光反应5h，离心（12000r/min，10min）收集沉淀，并用hepes溶液（20mm, ph =7.4）清洗3次，离心收集沉淀得到ncps
‑
ha。
20.实施例5：顺铂的体外释放实验将10mg实施例4制备的ncps
‑
ha分别置于20ml pbs溶液（0.01m，ph=7.4）或含有20mm谷胱甘肽（gsh）的pbs溶液（0.01m，ph=5.0）中，采用785nm近红外光照射5min，对照组无激光照射，于37℃、100r/min条件释放，分别在预定时间点取出3ml释放液，同时补充3ml新鲜的释放介质，并使用电感耦合等离子体光谱仪（icp
‑
oes）检测顺铂中铂（pt）的浓度，并计算pt的累积释放率。
21.如图2所示：在 ph=7.4且无gsh、无激光照射组，pt的释放缓慢；在ph=5.0和gsh存在环境，pt释放量在48h达到65%，经激光照射后，pt释放量达到78%。体外释放实验结果说明，ncps
‑
ha具有还原响应性和近红外光响应性释放顺铂的能力。
22.实施例6：ncps
‑
ha的细胞摄取实验取对数生长期的a549细胞以1
×
106细胞/孔的数量接种于6孔板中，在37℃培养过夜，弃去培养基，用pbs溶液（0.01m，ph=7.4）洗涤3遍，在避光条件下分别加入含游离cypate、实施例2制备的ncps、实施例4制备的ncps
‑
ha的载药培养基2ml（cypate浓度为10
µ
g/ml），继续培养4 h后，弃掉旧的培养基，pbs溶液（0.01m，ph=7.4）清洗3次，用1ml 0.25wt%的胰酶消化1min，再加入1ml培养基终止消化并收集培养基离心（1500r/min，5min），弃掉上清，用500
µ
l pbs溶液（0.01m，ph=7.4）重悬细胞。通过流式细胞仪检测a549细胞中cypate的摄取量。
23.如图3所示：ncps组的荧光强度明显高于游离cypate组，ncps
‑
ha组的荧光强度明显高于ncps组。细胞摄取实验结果说明，a549细胞对ncps
‑
ha的摄取量最高。这是由于ncps表面修饰的透明质酸具有主动靶向肿瘤细胞表面cd44受体的作用，促进了肿瘤细胞对材料的摄取。
24.实施例7：ncps
‑
ha的抑瘤实验将对数生长期的a549细胞用1ml 0.25wt%的胰蛋白酶消化1min，再加入1ml培养基终止消化并收集培养基进行离心（1500rpm，5min），弃掉上清，用3.6ml无菌生理盐水重悬细胞，给每只裸鼠（4
‑
5周龄，体重20g左右）右后肢外侧皮下注射200l细胞悬液，每只裸鼠5
×
106个细胞。将肿瘤体积为80
‑
100mm3的荷瘤裸鼠随机分为4组，每组3只。将各组材料（游离cypate/pt组、ncps加激光照组、ncps
‑
ha加激光照组）按照cypate浓度10mg/kg分别注入各只荷瘤裸鼠，给药1d后激光照射组进行785nm激光照射。生理盐水组为阴性对照组。实验期间每两天测量一次肿瘤体积。
25.如图4所示：在14d时，与对照生理盐水组和游离药物组相比，激光照射后，ncps和ncps
‑
ha组对肿瘤的生长均表现出明显的抑制作用，ncps
‑
ha组甚至出现了肿瘤消融，抑瘤效果明显优于ncps。抑瘤实验结果说明，ha的主动靶向作用促进了材料在肿瘤组织的富集，增强了抑瘤效果。
26.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。