用于不同组织再生的PRP凝胶组织工程复合物原位构建的方法与配方与流程

用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法与配方
技术领域
1.本发明涉及组织器官再生技术领域，具体涉及一种用于不同组织再生的自体prp凝胶组 织工程复合物原位构建的方法与配方。


背景技术：

2.大面积组织缺损的再生修复极为困难，采用自体组织移植会带来出血、感染及新的损伤， 且来源有限。由创伤、感染、肿瘤、烧伤等引起的大面积组织缺损是临床治疗的棘手问题， 采用传统的自体组织或同种异体组织移植及生物材料填充，由于存在种种弊端，治疗效果均 不理想，严重限制了其临床应用。
3.目前，组织修复材料大多为支架材料负载细胞生长因子模式。支架材料和生长因子的选 择是组织工程学研究的重点内容。目前常用的支架材料多为固体类材料，其在组织修复材料 的制备中已取得了令人瞩目的效果。但是，也不同程度地存在难以塑形、负载生长因子和种 子细胞操作复杂、负载率不高、细胞流失等缺陷。因此，注射型或水凝胶类材料是目前组织 修复材料研究的热点。
4.常用于组织修复材料领域的细胞生长因子有bmp、tgf
‑
β、bfgf、vegf等，均为外源性 蛋白(异种或异体蛋白因子)。从这些生长因子的制备方法分析，包括异体组织提取和基因 重组两种，其制备复杂、价格昂贵。从免疫学角度看，目前常用的各类生长因子均为外源性 (非自体)蛋白或多肽类，不同程度存在免疫反应。研究开发制备简单、价格低廉、无免疫 排斥的自体生长因子用于组织修复材料的制备，是组织修复材料进一步临床应用亟待解决的 重要问题。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种用于不同组织再生的自体prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法 与配方，以提供一种制备简单、价格低廉、无免疫排斥的自体生长因子用于组织修复材料配 方。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工 程复合物原位构建的配方，prp凝胶包括如下原料：凝血酶冻干粉、葡萄糖酸钙注射液、prp 液。
7.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的配方，prp凝胶包括如下 原料：凝血酶冻干粉、葡萄糖酸钙注射液、prp液、间充质干细胞。
8.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法，prp凝胶体外构建 方法如下：
9.s1：无菌条件下，将2ml葡萄糖酸钙注射液注入2000u的凝血酶冻干粉安瓿瓶内，摇 匀直至充分溶解成葡萄糖酸钙/凝血酶混合液，用1ml注射器抽取该液0.5ml；
10.s2：用10ml注射器抽取prp液4.5ml；
11.s3：将准备好的葡萄糖酸钙/凝血酶混合液0.5ml和prp液4.5ml的注射器分别与移植 枪内外套管针注射接口相连，同时同步将葡萄糖酸钙/凝血酶混合液与prp注入盐水安瓿空 瓶内，静置，得prp凝胶，体外构建的凝胶液各成分比例为凝血酶活力为100u/ml，间充质 干细胞为2
×
106个/ml，葡萄糖酸钙注射液浓度为10mg/ml，prp液为4.5ml；
12.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法，prp凝胶体内构建 方法如下：
13.s1：无菌条件下，将2ml葡萄糖酸钙注射液注入2000u的凝血酶冻干粉安瓿瓶内，摇 匀直至充分溶解成葡萄糖酸钙/凝血酶混合液，用1ml注射器抽取该液0.5ml；
14.s2：用10ml注射器抽取prp液4.5ml；
15.s3：在肌骨超声引导下，将准备好的葡萄糖酸钙/凝血酶混合液0.5ml和prp液4.5ml 的注射器分别与移植枪内外套管针注射接口相连，同时同步将葡萄糖酸钙/凝血酶混合液与 prp注入病损部位。
16.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法，对腰椎间盘退变 原位进行prp凝胶塑形如下：
17.s1：影像引导下利用干细胞移植枪穿刺套管针进行穿刺，针尖精准定位于靶部位；
18.s2：在相同的时间内通过穿刺套管针两个相互隔离的通道同步将血小板活化剂即0.2ml 葡萄糖酸钙液和2ml的prp注入体内靶点部位；
19.s3：这两种液体在流出针尖前的瞬间得以充分混合，在靶部位形成与病损形状大小吻合 的细胞凝胶复合物支架
20.优选的，作为一种改进，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞的获 取方法如下：用含有肝素抗凝液的注射器获取骨髓血200ml，将获取的骨髓血打入医用无菌 采血袋中；
21.将骨髓血与等体积的pbs混合，室温条件下静置30min，离心分离，弃上清液取细胞， 细胞用pbs清洗2次；再用弃去上清液等量的培养基悬浮细胞，其有核细胞数在(1～2)
×ꢀ
107个/ml。
22.优选的，作为一种改进，离心分离方式如下：吸取密度位1.073g/ml percoll溶液上， 使其与分离液比例为1：1；用水平离心机2000r/min条件下离心20～40min，使离心管内液 体从上至下分为三层，上层为血小板、中层为分离液、底层为红细胞和多核白细胞，在上、 中层液体界面处可见乳白色混浊的单个核细胞层；
23.将吸管插入到上、中层液体界面处的单个核细胞层，沿试管边缘吸取有核细胞移入另 一离心管中；用≥5倍的培养基悬浮细胞，再用水平离心机在2000r/min条件下离心10min， 弃上清液取细胞；用培养基再悬细胞，计数，用2％苔盼蓝测定细胞活力，调节细胞浓度为1
ꢀ×
106个/ml。
24.优选的，作为一种改进，骨髓间干细胞培养方式如下：按1.5
×
105个/cm2底面积接种到 培养皿，在37℃、饱和湿度、5％co2培养箱培养，培养48h后，可见少量细胞贴壁，2w后 达到85％细胞融合，即可进行消化、传代接种以及条件培养基诱导培养，扩增至第3
‑
5代使 用。通过细胞计数后重悬，调整到每ml营养液中含间充质干细胞2
×
106个/ml。
25.本方案的原理及优点是：
26.(1)富血小板血浆(plate rich plasma,prp)是从全血中分离出来的含高浓度血
小 板的血浆。近年来的研究发现，从自体静脉血中，经过体外离心、分离，提取的血小板血浆 (prp)中含有多种高浓度的有利于促进组织再生的生长因子。prp的成分为血小板、白细胞 以及纤粘蛋白等其他生长因子，如：血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮细胞生长因子 (vegf)、表皮生长因子(egf)。血小板经激活以后，可以释放大量的生长因子和细胞因 子，白细胞具有抗感染功能，而纤粘蛋白可以提供细胞支架。
27.(2)本方案中，套管针的内外管道互相隔离，而在离开针尖前的瞬间充分混合充填在 在病损部位，确保一次性快速形成mscs/prp凝胶复合物支架。
28.(3)本方案中，由于使用的移植枪内外套管针的内外管道互相隔离，针尖的特殊结构 促使两个通道的溶液在离开针尖前的瞬间充分混合，迅速充填于病损部位进而凝固为形状大 小与病损相吻合的mscs/prp凝胶复合物支架，有利于病损组织器官形态与功能的再生修复， 从而有望从根本上逆转组织缺损的病理进程，因此意义重大。
29.同时，本方案中，包括不限于以下优势：
30.1、采集自体prp，避免了免疫排斥、伦理的限制以及感染疾病的风险，且操作可行性强， 适宜临床应用；
31.2、可极大地改善原位病理微环境：prp含有多种抗炎因子，如可溶性肿瘤坏死因子受体 (stnf
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r)、白细胞介素
‑
受体拮抗剂(il
‑
ra)、白细胞介素4(il
‑
4)、il
‑
10和il
‑
13 等；
32.3、可提供干细胞生存需要的营养以及大量生长因子，重建病损组织器官的再生微环境： prp含有远超生理浓度的血小板，血小板激活后释放大量生长因子，介导组织修复，如转化 生长因子
‑
β1(tgf
‑
β1)、血小板衍生生长因子(pdgf)、胰岛素样生长因子(igf)、 egf等；
33.4、prp中的黏附、趋化因子等可诱导内源性干细胞迁移至损伤部位参与病损组织器官 的再生修复；
34.5、自体prp凝胶为高渗透性纤维蛋白凝胶使其能成为优秀适宜的细胞支架，能为mscs 提供附着的场所，而且能促进营养物质和代谢产物的扩散，易于建立细胞间的接触，促进功 能化组织器官形成；
35.6、通过移植枪内外套管针将凝胶形成液s1和液s2注入病损组织器官内，固化前充填 于病损组织器官、瞬间形成与病损形状大小吻合的细胞凝胶复合物支架，参与形态与功能的 完美重塑。
附图说明
36.图1为本发明实施例中1h时a和b中prp凝聚情况的对照图。
37.图2为本发明实施例中稳定时a、b和c中三组prp凝聚情况对照图。
38.图3为本发明实施例中内外套管针的结构示意图。
39.图4为本发明实施例中内外套管针的局部放大图。
具体实施方式
40.下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
41.说明书附图中的附图标记包括：外套管针11、进液孔a12、内套管针13、进液孔b13、 间隙15、出口位置16。
42.实施例一：
43.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的配方，包括如下原料：凝 血酶冻干粉、葡萄糖酸钙注射液、prp液。
44.一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合物原位构建的方法，包括如下步骤：
45.prp凝胶体外构建包括如下步骤：
46.s1：无菌条件下，将2ml葡萄糖酸钙注射液(葡萄糖酸钙1g/10ml)注入2000u的凝 血酶冻干粉安瓿瓶内，摇匀直至充分溶解成葡萄糖酸钙/凝血酶混合液，用1ml注射器抽取 该液0.5ml；
47.s2：用10ml注射器抽取prp液4.5ml，prp的获取采用现有的机械采集或人工采集。
48.s3：将准备好的葡萄糖酸钙/凝血酶混合液0.5ml和prp液4.5ml的注射器分别与移植 枪内外套管针注射接口相连，同时同步将葡萄糖酸钙/凝血酶混合液与prp注入盐水安瓿空 瓶内，静置，得prp凝胶。体外构建的凝胶液各成分比例为凝血酶活力为100u/ml，间充质 干细胞为2
×
106个/ml，葡萄糖酸钙注射液浓度为10mg/ml，prp液为4.5ml。
49.实施例二：
50.实施例二与实施例一的不同之处在于，一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合 物原位构建的方法，
51.prp凝胶体内构建包括如下步骤：
52.s1：无菌条件下，将2ml葡萄糖酸钙注射液(葡萄糖酸钙1g/10ml)注入2000u的凝 血酶冻干粉安瓿瓶内，摇匀是充分溶解成葡萄糖酸钙/凝血酶混合液，用1ml注射器抽取该 液0.5ml；
53.s2：用10ml注射器抽取prp液4.5ml
54.s3：在肌骨超声引导下，将准备好的葡萄糖酸钙/凝血酶混合液0.5ml和prp液4.5ml 的注射器分别与移植枪内外套管针注射接口相连，同时同步将葡萄糖酸钙/凝血酶混合液与 prp注入病损部位，并在病损部位形成prp凝胶，体内构建的凝胶液各成分比例为凝血酶活 力为100u/ml，间充质干细胞为2
×
106个/ml，葡萄糖酸钙注射液浓度为10mg/ml，prp液为 4.5ml；
55.s4：术毕拔出套管针，贴好无菌敷料于术后20分钟(暂定术后20分钟，可据体外prp/ 葡萄糖酸钙凝胶形成时间再行调整)，用超声观察体内prp/葡萄糖酸钙植入靶部位的凝胶形 成情况，并与prp/ns对照观察。
56.实施例三
57.实施例三与实施例二的不同之处在于，一种用于不同组织再生的prp凝胶组织工程复合 物原位构建的方法，本实施例中是对腰椎间盘退变原位进行prp凝胶塑形，包括如下步骤：
58.s1：影像引导下利用干细胞移植枪穿刺套管针进行穿刺，针尖精准定位于靶部位；
59.s2：在相同的时间内通过穿刺套管针两个相互隔离的通道同步将血小板活化剂即0.2ml 葡萄糖酸钙液和2ml的prp注入体内靶点部位；
60.s3：这两种液体在流出针尖前的瞬间得以充分混合，在靶部位形成与病损形状大小吻合 的细胞凝胶复合物支架。
针13的针管部分位于外套管针11的针管部分内，并内套管针13的针管部分与外套管针11 的针管部分之间构成间隙15。
75.外套管针11上设置有与其针管连通的进液孔a12，内套管针13上设置有与其针管连通 的进液口b14，外套管针11与内套管13针连通。
76.本实施例中使用方式如下：将准备好的葡萄糖酸钙/凝血酶混合液0.5ml的注射器与进 液孔b14连通，再将prp液4.5ml的注射器于进液孔a12连通，同时同步将葡萄糖酸钙/凝 血酶混合液与prp液分别注入到内套管针13和外套管针11内，内套管针13内的葡萄糖酸 钙/凝血酶混合液0.5ml流动至出口位置16，外套管针11内的prp液4.5ml在间隙16内流 动至出口位置16，则两种液体相遇混合，再进入至缺损位置。(本实施例中，实心箭头表示： 内套管针内液体流动方向，空心箭头表示：外套管针内液体流动方向，实心箭头与空心箭头 交错表示：内外套管内的液体混合)。
77.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未 作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下， 还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实 施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中 的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。