一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法及水凝胶的应用与流程

1.本发明属于生物材料领域，特别涉及一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法及其应用。


背景技术：

2.牛皮是家牛的皮肤组织，在屠宰业中产量较大，由于食用价值不大，大多用于皮革制造。然而，制革工业会造成大量边角料浪费，且随着工业发展，高分子材料逐暂替代了传统的皮革材料，牛皮的应用价值大大减少，造成大量牛皮被浪费。
3.牛皮中含有大量的胶原蛋白，可用于制备敷料、吸血海绵等医用产品，能有效引导组织再生。附在牛皮上的毛发由角蛋白构成，可以提取出半胱氨酸，接枝到胶原蛋白上可使胶原蛋白在体温下交联形成水凝胶，将该水凝胶用于到腔洞型伤口的填充修复，能有效封堵伤口，避免伤口感染，并引导组织再生修复。
4.cn111825859a公开了一种具有自修复功能的仿生电子皮肤医用支架的制备方法和应用，其特征在于以从生物安全性较好的脱细胞胎牛皮真皮基质中提取的明胶为原料，再与生物相容性良好的导电高分子聚3,4
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乙烯二氧噻吩：聚苯乙烯磺酸盐(pedot:pss)溶液和自制的酸化碳纳米管(h
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mwcnts)复合，通过1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)交联得到一种具有多功能性的三维网络空间结构的水凝胶支架，该水凝胶生物相容性好，力学强度高，且兼具自修复性能和诱导组织再生修复性能，可广泛应用于皮肤创伤修复治疗。但不适合用于腔洞型伤口。
5.cn112521491a公开了一种用于制备水凝胶的胶原蛋白及其制备方法，设计了含有生物活性结构gfpger区域的胶原蛋白序列，并在胶原蛋白序列的若干位点引入具有氧化交联特性的半胱氨酸，通过大肠杆菌异源表达获得四种纯度较高的含半胱氨酸胶原蛋白。采用双氧水为交联剂对胶原蛋白进行交联制备得到水凝胶，其制备得到的胶原蛋白具有较好的温敏性，在氧化环境中能够形成稳定的水凝胶构筑，并对细胞无毒性，为药物控释载体的应用提供了较好的基础。该方法使用大肠杆菌作为原料，而非较容易获得的牛皮。
6.从以上可以看出，至今尚未有利用牛皮制备出适合于腔洞型伤口使用的温敏水凝胶。


技术实现要素：

7.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法，包括以下步骤：（1）牛皮预处理将牛皮去除毛发收集牛毛待用，将去除牛毛后的牛皮经去除皮下脂肪以及清洗、脱脂处理，备用；
（2）从牛皮提取胶原蛋白将步骤（1）得到的牛皮粉碎，放入到氯化钠溶液中浸泡一定时间，取出清洗干净后，加到盐酸溶液中，并加入蛋白酶提取一定时间；然后，把固体不溶物去除，溶液加到透析袋中透析，调节到合适的ph值和浓度，得到牛皮胶原蛋白溶液；（3）从牛毛提取半胱氨酸将步骤（1）收集到的牛毛加到浓盐酸内，在一定温度下反应一定时间；把固体不溶物去除，对溶液进行脱色后，把溶液的ph调节到一定值，收集析出物；把析出物加到稀盐酸内，加入金属粒进行反应，过滤，收集滤液；对滤液通入一定量的硫化氢，过滤，然后进行合适的ph和浓度的调节，得到牛毛半胱氨酸溶液；（4）温敏水凝胶干粉制备对步骤（2）得到的牛皮胶原蛋白溶液加入适量的n
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，加入步骤（3）得到的牛毛半胱氨酸溶液，搅拌一定时间，加入一定量无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，分装到西林瓶，灭菌，得到温敏水凝胶干粉；（5）可注射温敏水凝胶制备把适量生理盐水加到步骤（4）得到的温敏水凝胶干粉，搅拌均匀后用注射器吸出，得到可注射温敏水凝胶。
9.优选的，步骤（1）所述的脱脂具体为将去除牛毛的牛皮浸泡于5~10wt%碳酸钠溶液中10~30分钟；碳酸钠溶液的体积为牛皮体积2~5倍。
10.优选的，步骤（2）所述的氯化钠溶液质量为牛皮质量的10~20倍，浓度为0.01~0.1 m。
11.优选的，步骤（2）所述的浸泡一定时间为2~5小时。
12.优选的，步骤（2）所述的盐酸溶液浓度为0.01~0.1 m，固液比1:10~100，单位g/ml。
13.优选的，步骤（2）所述的蛋白酶为100~500 u/ml胃蛋白酶。
14.优选的，步骤（2）所述的提取一定时间为6~8小时。
15.优选的，步骤（2）所述的透析袋的截留分子量为1000~5000 da。
16.优选的，步骤（2）所述的调节到合适的ph值和浓度为使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到4.5~6.5，用ph值4.5~6.5的磷酸缓冲溶液把胶原蛋白溶液浓度调节到0.5~5%（w/w）。
17.优选的，步骤（3）所述的浓盐酸浓度为5~10 m、质量为牛毛质量的1.5~3倍。
18.优选的，步骤（3）所述的在一定温度下反应一定时间为100~150 o
c反应5~10小时。
19.优选的，步骤（3）所述的对溶液进行脱色为加入溶液重量0.1~0.5倍的活性炭，加热煮沸1~5小时后分离固体。
20.优选的，步骤（3）所述的脱色后，把溶液的ph调节到一定值具体调节ph为4.5~5。
21.优选的，步骤（3）所述的稀盐酸浓度为0.01~0.1 m，重量为析出物重量的50~100倍。
22.优选的，步骤（3）所述的金属粒为锡粒，金属粒重量为反应液体重量的十分之一；优选的，步骤（3）所述的加入金属粒进行反应为在25~85 o
c反应1~18小时。
23.优选的，步骤（3）所述的一定量的硫化氢为1~10 l。
24.优选的，步骤（3）所述的进行合适的ph和浓度的调节为使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到4.5~6.5，用ph值4.5~6.5的磷酸缓冲溶液把半胱氨酸溶液浓度调节到0.1~1%（w/w）。
25.优选的，步骤（4）所述的适量的n
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为n
‑
羟基琥珀酰亚胺0.0005~0.005 g/ml，1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.001~0.005 g/ml。
26.优选的，步骤（4）中原料用量关系为：按照质量比计，步骤（3）得到的牛皮胶原蛋白溶液:牛毛半胱氨酸溶液=1~5:1。
27.优选的，步骤（4）所述的搅拌一定时间为4~36小时。
28.优选的，步骤（4）所述的一定量无水乙醇为溶液体积的3~5倍。
29.优选的，步骤（5）所述的适量生理盐水为温敏水凝胶干粉重量的50~100倍。
30.本发明进一步提供上述制备方法得到的可注射温敏水凝胶。
31.本发明进一步提供上述可注射温敏水凝胶在腔洞型伤口修复材料制备上的应用。
32.优选的，所述的应用的方法为把可注射温敏水凝胶填充到腔洞型伤口内，待温敏水凝胶凝固。
33.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：（1）把用途不大的牛皮、牛毛转化为医疗器械，减少浪费。
34.（2）制备出的温敏水凝胶注射到伤口后可快速凝固，填充腔洞型伤口，避免伤口感染，引导伤口愈合。
35.（3）胶原蛋白和半胱氨酸均可被人体完全降解吸收，不会产生有害残留物。
36.附图说明
37.图1 温敏水凝胶的分子结构。
38.具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
40.实施例1本发明提供一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法。
41.一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法，包括以下步骤：（1）牛皮预处理将牛皮去除毛发收集牛毛待用，将去除牛毛后的牛皮经去除皮下脂肪以及清洗；浸泡于牛皮体积2倍的5wt%碳酸钠溶液中脱脂10分钟，得到经处理的牛皮。
42.（2）从牛皮提取胶原蛋白将步骤（1）得到的牛皮粉碎，放入到重量为牛皮的10倍的0.01 m氯化钠溶液中浸泡2小时，取出清洗干净后，加到0.01 m盐酸溶液中，固液比为1:10，并加入100 u/ml胃蛋白酶提取6小时。然后，把固体不溶物去除，溶液加到1000 da透析袋中透析，使用磷酸二氢钠
和磷酸氢二钠把ph值调节到4.5和胶原蛋白溶液浓度调节到0.5%（w/w），得到牛皮胶原蛋白溶液。
43.（3）从牛毛提取半胱氨酸将步骤（1）收集到的牛毛加到1.5倍重量的5 m盐酸内，在100 o
c反应5小时。把固体不溶物去除，对溶液加入溶液重量0.1倍的活性炭，加热煮沸1小时进行脱色后分离固体，把溶液的ph调节到4.5，收集析出物。把析出物加到重量50倍的0.01 m盐酸内，加入锡粒，锡粒重量为液体重量的十分之一，在25 oc反应1小时，过滤，收集滤液。对滤液通入1 l的硫化氢，过滤，使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到4.5，用ph值4.5的磷酸缓冲溶液把半胱氨酸溶液浓度调节到0.1%（w/w），得到牛毛半胱氨酸溶液。
44.（4）温敏水凝胶干粉制备对步骤（2）得到的牛皮胶原蛋白溶液加入n
‑
羟基琥珀酰亚胺0.0005 g/ml、1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.001 g/ml，把步骤（3）得到的牛毛半胱氨酸溶液，按照牛皮胶原蛋白溶液重量:牛毛半胱氨酸溶液重量为1:1添加，搅拌4小时，加入溶液体积3倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，分装到西林瓶，灭菌，得到温敏水凝胶干粉。
45.（5）可注射温敏水凝胶制备把温敏水凝胶干粉重量的50倍的生理盐水加到步骤（4）得到的温敏水凝胶干粉，搅拌均匀后用注射器吸出，得到可注射温敏水凝胶。
46.实施例2本发明提供一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法。
47.一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法，包括以下步骤：（1）牛皮预处理将牛皮去除毛发收集牛毛待用，将去除牛毛后的牛皮经去除皮下脂肪以及清洗；浸泡于牛皮体积3倍的7wt%碳酸钠溶液中脱脂20分钟，得到经处理的牛皮。
48.（2）从牛皮提取胶原蛋白将步骤（1）得到的牛皮粉碎，放入到重量为牛皮的15倍的0.05 m氯化钠溶液中浸泡3小时，取出清洗干净后，加到0.05 m盐酸溶液中，固液比为1:50，并加入300 u/ml胃蛋白酶提取7小时。然后，把固体不溶物去除，溶液加到3000 da透析袋中透析，使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到5.5和胶原蛋白溶液浓度调节到2%（w/w），得到牛皮胶原蛋白溶液。
49.（3）从牛毛提取半胱氨酸将步骤（1）收集到的牛毛加2倍重量的7 m盐酸内，在120 o
c反应7小时。把固体不溶物去除，对溶液加入溶液重量0.3倍的活性炭，加热煮沸3小时进行脱色后分离固体，把溶液的ph调节到4.8，收集析出物。把析出物加到重量75倍的0.05 m盐酸内，加入锡粒，锡粒重量为液体重量的十分之一，在50 o
c反应10小时，过滤，收集滤液。对滤液通入5 l的硫化氢，过滤，使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到5.5，用ph值5.5的磷酸缓冲溶液把半胱氨酸溶液浓度调节到0.5%（w/w），得到牛毛半胱氨酸溶液。
50.（4）温敏水凝胶干粉制备对步骤（2）得到的牛皮胶原蛋白溶液加入n
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羟基琥珀酰亚胺0.0025 g/ml、1
‑
乙
基
‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.003 g/ml，把步骤（3）得到的牛毛半胱氨酸溶液，按照牛皮胶原蛋白溶液重量:牛毛半胱氨酸溶液重量为3:1进行添加，搅拌24小时，加入溶液体积4倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，分装到西林瓶，灭菌，得到温敏水凝胶干粉。
51.（5）可注射温敏水凝胶制备把温敏水凝胶干粉重量的75倍的生理盐水加到步骤（4）得到的温敏水凝胶干粉，搅拌均匀后用注射器吸出，得到可注射温敏水凝胶。
52.实施例3本发明提供一种牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法。
53.一种把牛皮制备可注射温敏水凝胶的方法，包括以下步骤：（1）牛皮预处理将牛皮去除毛发收集牛毛待用，将去除牛毛后的牛皮经去除皮下脂肪以及清洗；浸泡于牛皮体积5倍的10wt%碳酸钠溶液中脱脂30分钟，得到经处理的牛皮。
54.（2）从牛皮提取胶原蛋白将步骤（1）得到的牛皮粉碎，放入到重量为牛皮的20倍的0.1 m氯化钠溶液中浸泡5小时，取出清洗干净后，加到0.1 m盐酸溶液中，固液比为1:100，并加入500 u/ml胃蛋白酶提取8小时。然后，把固体不溶物去除，溶液加到5000 da透析袋中透析，使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到6.5和胶原蛋白溶液浓度调节到5%（w/w），得到牛皮胶原蛋白溶液。
55.（3）从牛毛提取半胱氨酸将步骤（1）收集到的牛毛加3倍重量的10 m盐酸内，在150 o
c反应10小时。把固体不溶物去除，对溶液加入溶液重量0.5倍的活性炭，加热煮沸5小时进行脱色后分离固体，把溶液的ph调节到5，收集析出物。把析出物加到重量100倍的0.1 m盐酸内，加入锡粒，锡粒重量为液体重量的十分之一，在85 oc反应18小时，过滤，收集滤液。对滤液通入10 l的硫化氢，过滤，使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠把ph值调节到6.5，用ph值6.5的磷酸缓冲溶液把半胱氨酸溶液浓度调节到1%（w/w），得到牛毛半胱氨酸溶液。
56.（4）温敏水凝胶干粉制备对步骤（2）得到的牛皮胶原蛋白溶液加入n
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羟基琥珀酰亚胺0.005 g/ml、1
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乙基
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.005 g/ml，把步骤（3）得到的牛毛半胱氨酸溶液，按照牛皮胶原蛋白溶液重量:牛毛半胱氨酸溶液重量为5:1进行添加，搅拌36小时，加入溶液体积5倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，分装到西林瓶，灭菌，得到温敏水凝胶干粉。
57.（5）可注射温敏水凝胶制备把温敏水凝胶干粉重量的100倍的生理盐水加到步骤（4）得到的温敏水凝胶干粉，搅拌均匀后用注射器吸出，得到可注射温敏水凝胶。
58.应用例本发明可注射温敏水凝胶用于作为腔洞型伤口修复材料上的应用，具体为把可注射温敏水凝胶用于腔洞型伤口填充，待温敏水凝胶凝固。
59.把可注射温敏水凝胶加到螺口瓶中，把瓶盖拧紧，置于37 ℃水浴中，每1分钟取出
观察是否已经凝固，得到凝胶凝固时间。
60.把可注射温敏水凝胶加到圆柱体模具，置于37℃水浴中待其凝固，凝固后取出圆柱体水凝胶，切成厚约1 cm的样条，用万能材料测试机测试压缩强度。
61.结果如下表所示：上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。