一种CAR-T细胞的制备方法与流程

技术特征：
1.一种car-t细胞的制备方法，其特征在于，步骤包括：将pbmc细胞或t细胞同肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触培养，该pbmc细胞或t细胞胞内有含靶向抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸。2.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述接触培养条件为：培养温度37℃，培养co2浓度为5％，培养基为aim-v 2％fbs培养基，培养基中含有细胞因子，培养天数为5～10天。3.根据权利要求2所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞因子的终浓度为100～1000u/ml，优选为450～600u/ml；细胞因子选自il-2、il-15、il-12或il-21中任意一种或多种，优选为il-2。4.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体处于非固定化状态或固定化状态，优选为固定化状态。5.根据权利要求3所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，当为固定化状态时，肿瘤抗原的包被浓度为1～10ug/ml，优选为4.5～5ug/ml；抗cd28抗体的包被浓度为1～10ug/ml，优选为4.5～5ug/ml；抗cd6抗体的包被浓度为1～10ug ug/ml，优选为4.5～5ug/ml。6.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，还包括接触培养后，将接触培养所得细胞转移至不含肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体的培养基中进行常规培养。7.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述抗cd28抗体为人源抗cd28抗体、鼠源抗cd28抗体或兔源抗cd28抗体，优选为人源抗cd28抗体；进一步地，抗cd28抗体为抗cd28单克隆抗体或抗cd28多克隆抗体，优选为抗cd28单克隆抗体；所述抗cd6抗体为人源抗cd6抗体或鼠源抗cd6抗体，优选为人源抗cd6抗体；进一步地，抗cd6抗体为抗cd6单克隆抗体或抗cd6多克隆抗体，优选为抗cd6单克隆抗体。8.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，含有靶向抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸转入pbmc的方法选自病毒颗粒感染、电转、脂质体转染、磷酸钙转染和基因枪转染中任意一种，优选为电转。9.根据权利要求1或7所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体靶向的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原，包含但不限于以下任意一种或组合：cd19、cd20、cea、gd2、fr、psma、pmel、ca9、cd171/l1-cam、mart-1、erbb2、mage家族蛋白、bage家族、gage家族、afp、muc1、muc16、cd22、cd30、cd33、cd44v7/8、cd70、vegfr1、vegfr2、egp-2、egp-40、psa、msln、egfr、erbb3、erbb4、afu、her家族、epcam、igfr1、ca242或ca50等，优选为her家族，更优选为egfr。10.根据权利要求1所述car-t细胞的制备方法，其特征在于，含靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸为dna或者mrna，所述dna优选为表达载体，表达载体选自重组真核表达载体或重组病毒载体，重组真核载体包括但不限于pnb载体(转座质粒)、prs载体、puc载体、psv2载体、prsv载体、pcdna3.1载体、pvax1载体、pegfp载体或pcmvp-neo-ban载体，所述重组病毒载体包括但不限于重组腺病毒载体或慢病毒载体；所述mrna含有5’端帽子结构、5’utr、编码所述靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体的开放阅读框、3’utr和polya尾。

技术总结
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种CAR-T细胞的制备方法，步骤包括：将PBMC细胞或T细胞同肿瘤抗原、抗CD28抗体和抗CD6抗体接触培养，该PBMC细胞或T细胞胞内有含靶向抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸。通过该方法制备的CAR-T细胞质量统一、活性相近，解决ZAP70低表达导致的CAR-T细胞转染效率低、活化少、增殖差、质量控制难等问题，满足cGMP生产管理和大规模生产需求。规模生产需求。规模生产需求。


技术研发人员：方媛 刘韬 张亚军 钱其军
受保护的技术使用者：上海细胞治疗集团有限公司
技术研发日：2020.04.23
技术公布日：2021/10/26