一种CAR-T细胞的制备方法与流程

enhances car-t cell antitumor activity by reducing mtorc1 activity andpreserving their stem cell memory phenotype.cancer immunology research,d,a.,w.ra,y.x,w.d,p.jr,k.cf,a.b,q.y,a.dk,s.r,u.r,w.x,f.sj&b.ce,2019,7,759-772)、il-12(抗t12：一种激活人t淋巴细胞抗cd6单克隆抗体anti-t12,an anti-cd6 monoclonal antibody,can activate human t lymphocytes.journal of immunology(baltimore,md.:1950),rm,g.,s.ja,g.dm&r.pl,1989,143,2439-47.)和il-21(il-21选择性地保护cd62l nkt细胞并增强过继免疫疗法中的效应器功能il-21selectively protects cd62l nkt cells and enhances their effector functions for adoptive immunotherapy.journal of immunology(baltimore,md.:1950),h,n.,t.g,c.an,r.sb,g.l,l.b,j.j,s.et,d.p.ej&m.ls,2018,201,2141-2153)与等。il-2是体外car-t细胞培养过程中广泛使用的具有生物活性的细胞因子，可促进t细胞的增殖活化。il-15、il-12和il-21同样是可在体内发挥促进淋巴细胞增殖、分化及维持机体正常抗肿瘤作用的细胞因子，但难以对zap70弱表达的t细胞起作用。因为zap70是一种细胞质蛋白酪氨酸激酶，属于syk蛋白家族，仅表达于t细胞和自然杀伤细胞。zap70作为tcr的一部分，可通过调节t细胞表面tcr的表达来调节t细胞激活的开启和关闭，是t细胞受体活化必需因素。t细胞活化路径可概括为tcr/cd3复合体激活后，招募并激活zap70，从而磷酸化lat和cd6，最终激活slp-76依赖性招募和其它下游效应器来调节t细胞应答(malissen et al.2014)。故当zap70表达较弱时，t细胞近端tcr信号转导能力受损，便无法启动下游活化信号(ay et al.2016)。


技术实现要素：

5.本发明针对zap70弱表达的非正常免疫细胞(t细胞)提出一种car-t细胞的制备方法，该制备方法在无需对免疫细胞(t细胞)作其他特殊修饰的情况下，提升car-t细胞的转染率、活化率、增殖率，且该制备方法不影响正常免疫细胞(t细胞)的car-t细胞制备活性。当用于制备生产car-t细胞的免疫细胞(t细胞)质量不一时，尤其是患者体内自分离免疫细胞(t细胞)，无需其他特殊处理，即可增强非正常免疫细胞的car-t制备活性，并达到同正常免疫细胞相同或相近的car-t细胞制备活性，质量稳定可控，且方法简便，安全可控，适用于大规模生产。
6.本发明的技术方案为：一种car-t细胞的制备方法，步骤包括：将pbmc细胞或t细胞同肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触培养，该pbmc细胞或t细胞胞内有含靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸。
7.本发明接触培养的条件为：培养温度37℃，培养co2浓度为5％，培养基为aim-v 2％fbs培养基，培养天数为5～10天，培养天数优选为5～6天；培养基中含有细胞因子，细胞因子的终浓度为100～1000u/ml，优选为450～600u/ml；细胞因子选自il-2、il-15、il-12或il-21中任意一种或多种，优选为il-2。
8.本发明接触培养过程中，肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体处于非固定化状态或固定化状态，优选为固定化状态，肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体以共价或非共价的方式同基质连接，所述基质可以是固定的基质，如固体的孔板、培养皿、玻片等，也可以是悬浮的基质，如磁珠、纳米颗粒等。
9.当为固定化状态时，肿瘤抗原的包被浓度为1～10ug/ml，优选为4.5～5ug/ml；抗
cd28抗体的包被浓度为1～10ug/ml，优选为4.5～5ug/ml；抗cd6抗体的包被浓度为1～10ug/ml，优选为4.5～5ug/ml。
10.本发明car-t细胞制备方法还包括将接触培养后的细胞转移至不含肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体的培养基中进行常规培养，常规培养的条件为：培养温度37℃，培养co2浓度为5％，培养基为aim-v 2％fbs培养基，培养天数为5～10天，培养天数优选为5～6天；培养基中含有细胞因子，细胞因子的终浓度为50～1000u/ml，优选为50～200u/ml；细胞因子选自il-2、il-15、il-12或il-21中任意一种或多种，优选为il-2。
11.本发明抗cd28抗体为人源抗cd28抗体、鼠源抗cd28抗体或兔源抗cd28抗体，优选为人源抗cd28抗体；进一步地，抗cd28抗体为抗cd28单克隆抗体或抗cd28多克隆抗体，优选为抗cd28单克隆抗体。
12.本发明抗cd6抗体为人源抗cd6抗体或鼠源抗cd6抗体，优选为人源抗cd6抗体；进一步地，抗cd6抗体为抗cd6单克隆抗体或抗cd6多克隆抗体，优选为抗cd6单克隆抗体。
13.本发明含有靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸转入pbmc的方法选自病毒颗粒感染、电转、脂质体转染、磷酸钙转染和基因枪转染中任意一种，优选为电转。
14.本发明嵌合抗原受体靶向的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原包含但不限于以下任意一种或组合：cd19、cd20、cea、gd2、fr(flavin还原酶)、psma(前列腺特异性抗原)、pmel(前黑素小体蛋白)、ca9(碳酸酐酶
ⅸ
)、cd171/l1-cam、mart-1(黏蛋白a)、erbb2、mage(黑素瘤相关抗原e1)家族蛋白、bage(b黑素瘤抗原家族蛋白)家族、gage(生长激素释放因子家族蛋白)家族、afp、muc1、muc16、cd22、cd30、cd33、cd44v7/8、cd70、vegfr1、vegfr2、egp-2、egp-40、psa(激肽释放酶相关的肽酶3)、msln(间皮素)、egfr、erbb3、erbb4、afu、her家族、epcam、igfr1、ca242或ca50等，优选为her家族，更优选为egfr。
15.本发明含靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸为dna或者mrna，所述dna优选为表达载体，表达载体选自重组真核表达载体或重组病毒载体，重组真核载体包括但不限于pnb载体(转座质粒)、prs载体、puc载体、psv2载体、prsv载体、pcdna3.1载体、pvax1载体、pegfp载体或pcmvp-neo-ban载体等，所述重组病毒载体包括但不限于重组腺病毒载体或慢病毒载体等。所述mrna含有5’端帽子结构、5’utr、编码嵌合抗原受体的开放阅读框(orf)、3’utr和polya尾。
16.相对于现有技术，本发明的优点在于：本发明car-t制备方法克服因免疫细胞质量不一而导致的car-t细胞转染率低、活化少、增值差、质量控制困难等生产难问题。虽免疫细胞质量不一，尤其是zap70弱表达细胞，通过采用本发明制备方法，可将质量非正常免疫细胞的car-t细胞增殖与活化水平增强至与正常免疫细胞同活性水平，且本发明对正常免疫细胞的car-t细胞增殖与活化水平不产生不利影响。
附图说明
17.图1为实施例1胰腺癌panc-1细胞、bxpc-3细胞、aspc1细胞，肝癌hepg2、huh-7细胞、hep3b细胞，肺癌h460细胞、h292细胞、h23细胞表面人egfr抗原表达示意图。
18.图2为实施例1胰腺癌panc-1细胞、bxpc-3细胞、aspc1细胞，肝癌hepg2、huh-7细胞、hep3b细胞，肺癌h460细胞、h292细胞、h23细胞表面人egfr抗原表达水平统计结果。
19.图3为实施例2含有靶向egfr抗原的嵌合抗原受体序列的pnb338b-egfr载体示意图。
20.图4为实施例2不同供体的pbmc细胞zap70表达情况示意图。
21.图5为实施例2不同car-t制备方法下pbmc细胞转染car流式检测示意图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
22.图6为实施例2不同car-t制备方法下pbmc细胞转染car多次流式检测结果统计图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
23.图7为实施例3不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞体外培养扩增趋势图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
24.图8为实施例3不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞表面活化指标cd137流式检测示意图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
25.图9为实施例3不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞表面活化指标cd107α流式检测结果统计图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
26.图10为实施例3不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞表面活化指标cd107α流式检测结果统计图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
27.图11为实施例3不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的细胞表面cd45ro阳性的car-t细胞中cd62l和ccr7分子流式检测结果示意图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
28.图12为实施例4不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞同不同egfr抗原表达水平的肿瘤细胞共孵育后细胞因子释放水平检测。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
29.图13为实施例4不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞在不同效靶比时对靶细胞的杀伤结果示意图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
30.图14为实施例4不同car-t制备方法下由pbmc细胞制备而成的car-t细胞在不同效靶比时对靶细胞的杀伤结果统计图。其中，对照组添加抗cd3抗体和抗cd28抗体接触孵育，
egfr car-t组添加egfr抗原和抗cd28抗体接触孵育，egfr car-t/cd6组添加egfr抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触孵育。
具体实施方式
31.在本发明中，术语“过继性免疫细胞疗法(adoptive cell transfer therapy,act)”指把致敏淋巴细胞(具有特异免疫力的)或致敏淋巴细胞的产物(例如转移因子和免疫核糖核酸等)输给细胞免疫功能低下者(如肿瘤病人)，使其获得抗肿瘤免疫力的疗法。
32.术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)”指一类工程化受体，将一种被定义的特异性移植到免疫效应器细胞上，通常是t细胞，并增强t细胞的功能。
33.术语“编码序列”为核酸序列中直接确定其蛋白质产物(如car)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mrna5’端开放阅读框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mrna3’端开放阅读框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括但不限于dna、cdna和重组核酸序列。
34.术语“核酸构建体”为可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。术语“表达载体”为重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体。
35.术语“抗体”为与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子，可为自然来源或重组来源的完整的免疫球蛋白，或可为免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、fv、fab、scfv、人源化抗体、重链抗体或单域抗体。
36.术语“单克隆抗体”为表现单一结合特异性的抗体，仅结合单一的抗原表位。
37.术语“多克隆抗体”为含有多种由体内不同b细胞谱系分泌产生的抗体的抗体的混合物。
38.术语“人源化抗体”为序列经过修饰后与其天然的人类的抗体序列相比相似度提高的非人源抗体。
39.术语“非固定化”为蛋白抗原或抗体不与任何基质已共价或非共价的方式相连接。所述基质可以是固定的基质，如固体的孔板、培养皿、玻片等，也可以是悬浮的基质，如磁珠、纳米颗粒等。
40.术语“固定化”为抗原或抗体以共价或非共价的方式与基质相连接，所述基质可以是固定的基质，如固体的孔板、培养皿、玻片等，也可以是悬浮的基质，如磁珠、纳米颗粒等。
41.术语“单链可变区片段(single chain variable fragment,scfv)”：通常由一个vh和一个vl通过肽链连接在一起组成的单链抗体。
42.术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,mhc)”：是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。
43.术语“外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)”：是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
44.本领域car-t细胞的常规制备方法为：先分离获得pbmc，再用cd3和抗cd28抗体分别作为第一信号和第二信号协同激活扩增t淋巴细胞，最后用病毒颗粒或电转染将转基因car导入t细胞。患者体内的t淋巴细胞及pbmc细胞因体内环境变化或外界干扰等因素影响而质量参差不齐且不可控，出现car-t细胞制备过程中转染效率低、活化少、增殖差、质控难等问题，导致临床转化困难。
45.现有技术发现zap70弱表达导致激活t淋巴细胞的cd3第一信号和cd28第二信号无法协同发挥激活作用，继而影响car-t细胞制备过程中的增殖与活化。同时，现有技术表明t细胞活化途径中的cd6是表达于未成熟胸腺细胞、外周血t细胞和b1a细胞的细胞表面受体，与tcr/cd3复合体共定位于免疫突触(t细胞中cd6-tcr/cd3相互作用的生物学特性(biophysical characterization of cd6-tcr/cd3 interplay in t cells.frontiers in immunology,mbm,m.,m.sfb,c.fb,t.r.j,k.js,j.b,w.jj,b.r,f.cg&c.a，2018,9,2333.))。cd6可响应tcr/cd3复合体激活所触发的信号机联反应，同时也可作为一种共刺激分子促进t细胞活化和增殖。故而在t细胞zap70表达情况较差时，在现有的car-t激活方案基础上采用新的工艺(添加cd6抗体)，根据现有判断car-t细胞质量是否达标的标准，如car表达、体外增殖、细胞表型以及抗肿瘤效果等多角度评估新的工艺对car-t细胞的优化效果，并探讨相关作用机制，为car-t疗法临床治疗研究提供实验基础。
46.基于此，本发明car-t细胞制备方法如下：将pbmc细胞或t淋巴细胞同肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体接触培养，该pbmc细胞或t淋巴细胞胞内有含靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸。通过该方法制备的car-t细胞质量统一、活性相近，解决zap70低表达导致的car-t细胞转染效率低、活化少、增殖差、质量控制难等问题，满足cgmp生产管理和大规模生产需求。
47.本发明嵌合抗原受体靶向的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原包含但不限于以下任意一种或组合：cd19、cd20、cea、gd2、fr(flavin还原酶)、psma(前列腺特异性抗原)、pmel(前黑素小体蛋白)、ca9(碳酸酐酶
ⅸ
)、cd171/l1-cam、mart-1(黏蛋白a)、erbb2、mage(黑素瘤相关抗原e1)家族蛋白、bage(b黑素瘤抗原家族蛋白)家族、gage(生长激素释放因子家族蛋白)家族、afp、muc1、muc16、cd22、cd30、cd33、cd44v7/8、cd70、vegfr1、vegfr2、egp-2、egp-40、psa(激肽释放酶相关的肽酶3)、msln(间皮素)、egfr、erbb3、erbb4、afu、her家族、epcam、igfr1、ca242或ca50等，优选为her家族，更优选为egfr。
48.本发明含靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸为dna或mrna，实现嵌合抗原受体在宿主细胞内的表达编码，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌等。当所述核酸为dna时，为可操作地连接一个或多个调控序列的核酸构建体，指导目标序列嵌合抗原受体在宿主细胞内表达编码，优选为表达载体，选自重组真核表达载体或重组病毒载体，重组真核载体包括但不限于pnb载体(转座载体)、prs载体、puc载体、psv2载体、prsv载体、pcdna3.1载体、pvax1载体、pegfp载体或pcmvp-neo-ban载体等，所述重组病毒载体包括但不限于重组腺病毒载体或慢病毒载体等。所述转座载体可以是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、tn5或ty的转座原件的真核表达载体，该类转座载体中含有相应转座子的5’反向末端重复序列和相应转座子的3’反向末端重复序列。转座酶选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、tn5或ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’ltr和3’ltr的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，为本领域技术人员容易确定的常规技术选择。在本发明某些实施方案中，所述表达载体为pnb转座载体，转座酶为来自piggybac系统的转座酶，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。所述mrna含有5’端帽子结构、5’utr、编码嵌合抗原受体的开放阅读框(orf)、3’utr和
polya尾。
49.在本发明某些实施方案中，嵌合抗原受体靶向肿瘤抗原的胞外抗原结合区为针对人表皮生长因子受体的家族的scfv，优选为针对表皮生长因子受体1的scfv。所述对人表皮生长因子受体1的scfv的dna编码序列优选为seq id no:1的第78-800位。
50.本发明抗cd28抗体为人源抗cd28抗体、鼠源抗cd28抗体或兔源抗cd28抗体，优选为人源抗cd28抗体；进一步地，抗cd28抗体为抗cd28单克隆抗体或抗cd28多克隆抗体，优选为抗cd28单克隆抗体。
51.本发明抗cd6抗体为人源抗cd6抗体或鼠源抗cd6抗体，优选为人源抗cd6抗体，进一步地，抗cd6抗体为抗cd6单克隆抗体或抗cd6多克隆抗体，优选为抗cd6单克隆抗体。
52.本发明接触培养过程中，肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体处于非固定化状态或固定化状态，优选为固定化状态，肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体以共价或非共价的方式同基质连接，所述基质可以是固定的基质，如固体的孔板、培养皿或玻片等，也可以是悬浮的基质，如磁珠、纳米颗粒等。
53.当为固定化状态时，肿瘤抗原的包被浓度为1～3ug/ml，优选为1.5～2ug/ml；抗cd28抗体的包被浓度为1～3ug/ml，优选为1.5～2ug/ml；抗cd6抗体的包被浓度为1～3ug/ml，优选为1.5～2ug/ml。
54.本发明接触培养为本领域常规的t细胞培养方法，条件为：培养温度37℃，培养co2浓度为5％，培养基为aim-v 2％fbs培养基，培养天数为5～10天，培养天数优选为5～6天；培养基中含有细胞因子，细胞因子的终浓度为100～1000u/ml，优选为450～600u/ml；所述细胞因子选自il-2、il-15、il-12、il-21中任意一种或多种，优选为il-2。
55.本发明car-t细胞培养方法还包括将接触培养后的细胞转移至不含肿瘤抗原、抗cd28抗体和抗cd6抗体的常规t细胞培养基中进行常规培养，条件为：培养温度37℃，培养co2浓度为5％，培养基为aim-v 2％fbs培养基，培养天数为5～10天，培养基中含有细胞因子，细胞因子的终浓度为50～1000u/ml，优选为50～200u/ml；所述细胞因子选自il-2、il-15、il-12、il-21中任意一种或多种，优选为il-2。
56.本发明含有靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码序列的核酸转入pbmc细胞的方法选自病毒颗粒感染、电转、脂质体转染、磷酸钙转染和基因枪转染中任意一种，优选为电转。在本发明某些实施例，靶向egfr抗原的嵌合抗原受体通过含有其编码序列的重组pnb338b-egfr载体电转导入pbmc细胞中。
57.本发明pbmc细胞的来源可以为本领域常规来源，例如通过ficoll密度梯度离心法从供体受试者的血液中分离获得，也可以为市售购买的pbmc。
58.实施例1：肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原egfr表达丰度的检测
59.1肿瘤细胞的培养
60.1.1复苏实验所需肿瘤细胞系：细胞人胃癌细胞株hgc27，人卵巢癌细胞株skov3，人胰腺癌细胞株panc 1、bxpc-3和aspc-1，人肝癌细胞株hep3b，人肺癌细胞株h460、h292和h23，结肠癌细胞株colo 205均购于atcc；人肝癌细胞株hepg2和huh7购于中科院；
61.1.2将不同类型肿瘤细胞分别培养于适宜的配置好的培养基中(一般使用dmem或rpmi-1640培养基，并添加5％-10％灭活胎牛血清)，置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱内培养；
62.1.3培养数代、细胞状态良好且肿瘤细胞融合至80％左右，消化计数。
63.2流式细胞术检测不同肿瘤细胞表面egfr的表达
64.2.1按照1.3中计数结果取适量肿瘤细胞悬液加入至1.5ml的ep管，每管5
×
105个细胞；
65.2.2根据egfr抗体推荐使用量向细胞悬液中加入egfr流式抗体并重悬至50ul，混匀，4℃避光孵育30min；
66.2.3向孵育抗体后的细胞悬液中加1ml的pbs，室温下3000rpm，离心3min，弃去上清，重复操作1次；
67.2.4吸取400μl的pbs重悬细胞，转移至流式管中，调节流式细胞仪参数，设门选择目标细胞群，收集流式检测实验数据；
68.2.5使用kaluza analysis软件分析检测结果，其中图1为不同肿瘤细胞表面egfr肿瘤相关抗原流式检测结果；
69.2.6使用graphpad prism 8.0.1软件对各肿瘤细胞多次检测实验数据进行统计，图2即为不同肿瘤细胞表面egfr肿瘤相关抗原多次流式检测结果统计结果。
70.上述图1和图2结果显示，三种不同肿瘤胰腺癌、肝癌、肺癌的三种不同肿瘤细胞系表面均有不同程度的egfr表达，其中胰腺癌panc 1、肺癌h292两个细胞株高表达egfr，胰腺癌bxpc-3/aspc1、肝癌huh-7/hep3b四个细胞株中度表达egfr，肝癌hepg2、肺癌h460/h23三个细胞株低表达或不表达egfr。
71.实施例2：稳定表达egfr car的t细胞的构建和激活
72.1外周血单个核细胞的分离和冻存
73.1.1ficoll分装：根据样本量，准备若干个50ml离心管中装入ficoll溶液，每管15ml备用；
74.1.2使用50ml注射器在血袋出血口处将血吸出，根据样本量将吸出的血液加入到干净的50ml离心管中待稀释；
75.1.3将30ml全血用dpbs稀释至60ml，再按每管20ml分装至50ml离心管中；
76.1.4在避光的情况下，将稀释的血液轻轻加到在20℃水浴锅中充分加热过的ficoll上层，避免两种溶液混合在一起，每个离心管各35ml混合溶液；离心800g，20min(离心机升速为1，降速为0)，离心完毕将出现分层；
77.1.5pbmc所在细胞层为白色。此时用1000μl移液器将该层细胞吸取到另一干净的50ml离心管中；
78.1.6加入3倍体积dpbs后充分混匀之后，放入离心机中离心1500rpm，10min后去掉上清，再加入适量dpbs重悬；
79.1.7取10μl细胞悬液与10μl 0.4％台盼蓝溶液充分混匀后加入到与细胞计数仪配套的细胞计数板中进行计数。之后再加入3倍体积dpbs离心1500rpm，10min后去掉上清；
80.1.8细胞贴壁：将细胞离心收集之后，用aim-v培养基按5*10^6个细胞/ml体积重悬，根据重悬体积选择适当的培养瓶进行细胞贴壁培养，将培养瓶放入37℃，5％co2培养箱培养2h-4h或过夜；
81.1.9悬浮细胞收集：培养后将培养基和悬浮细胞收集到50ml离心管中，并用dpbs对培养瓶进行1次清洗，将清洗液收集到50ml离心管中，离心1500rpm，10min后去掉上清，再加
入适量dpbs充分重悬。
82.1.10取10μl细胞悬液与10μl 0.4％台盼蓝溶液充分混匀后加入到与细胞计数仪配套的细胞计数板中进行计数。计数后细胞离心1500rpm，10min后去掉上清；
83.1.11将细胞离心收集之后，按1
×
107细胞/ml的细胞冻存液体积重悬。冻存管中加入取1ml细胞和冻存液混合液，放入细胞冻存盒中，再将其放置于-80℃冰箱24h。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
84.2检测外周血单个核细胞zap70的表达
85.为了检测pbmc的zap70表达情况，使用western blot法进行测定。
86.2.1蛋白提取
87.2.1.1收集细胞至1.5ml ep管，1000rpm，离心3min，弃去上清，加入适量生理盐水或dpbs清洗细胞，1000rpm，离心3min，弃尽上清，留取细胞沉淀。
88.2.1.2加入裂解液混匀细胞(80ul/1
×
106)，冰上裂解20min。
89.2.1.3 4℃，12000rpm离心10min，吸取上清(取1-3ul用于bca定量
90.2.2bca定量
91.2.2.1取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各25ul，加至微孔板中(检测范围20-2000ug/ml)。
92.2.2.2在每个孔中加入200ul工作液，振荡器震荡30s，充分混合溶液。
93.2.2.3将微孔板密封，37℃孵育30min。
94.2.2.4将微孔板冷却至室温，使用酶标仪测量样品在562nm的吸光值。
95.2.2.5将各个标准品蛋白质和待测蛋白质样品在562nm的吸光值减去空白标准品在562nm的吸光值。
96.2.2.6将bsa标准品在562nm的吸光值经过空白对照校正的平均吸光值对其浓度作图，绘制标准曲线。根据待测样品的吸光值在标准曲线上确定其浓度。
97.2.3煮样
98.2.3.1在收集的上清液加入适量1
×
加样缓冲液，98℃金属浴10min。
99.2.3.2处理后冰上放置2min，-20℃短期保存，-80℃长期保存
100.2.4sds-page胶配制(按照雅酶公司快速制胶试剂盒制备)
101.2.5转膜
102.2.5.1待电泳结束后，轻轻拆开玻璃板，切去多余的胶，将切好的胶块放至电转液中保持湿润状态；剪取适当大小的pvdf膜，放置甲醇中活化2min；剪取比pvdf膜略大(长宽各0.3-0.5cm)的厚滤纸2张。
103.2.5.2半干转：将厚滤纸、pvdf膜、胶放至转膜缓冲液中平衡10min，按以下顺序装配好转膜设备(厚滤纸-pvdf膜-胶-厚滤纸)，在电泳槽中加一些转膜液湿润，设好转膜条件开始转膜。(16v，25min)。
104.2.6封闭：从电转仪中取出pvdf膜，将膜放入提前配制好的5％脱脂奶粉或5％bsa中，低速摇床上室温封闭2h。
105.2.7一抗孵育：加入相应按照相应稀释比例稀释的一抗(由5％脱脂奶粉或tbst配制)，4℃孵育过夜。
106.2.8洗膜：回收一抗。加入适量1
×
tbst摇床10min，重复三次。
107.2.9二抗孵育：加入相应种属hrp偶联的二抗室温孵育1h。
108.2.10洗膜：回收二抗。加入适量1
×
tbst摇床10min，重复三次。
109.2.11显影：根据pvdf膜的大小确定发光液的用量，取等体积a液和b液，混匀后保存备用，用镊子取出膜，铺在一层保鲜膜上，在膜的中央加入混好的溶液，放至ai600化学发光成像仪中拍照。
110.2.12数据分析.
111.上述检测结果如图4显示，随机挑取的5个不同供体的pbmc检测结果中，2个供体pbmc显示zap70强表达，3个供体显示zap70表达较弱。
112.3制备egfr car-t细胞
113.使用电转染技术将本实验室构建保存质粒egfr car质粒(如图3，pnb338b载体质粒结构参见cn201711476630.6，构建参见cn201711459160.2或cn201711462801.x，egfr car序列如seq id no:1所示)，其中egfr scfv编码序列参见seq id no:1的第78-800位，pnb载体(转座载体)转染至pbmc中，制备得到egfr car-t细胞。电转染是使用lonza 4d电转仪来完成。
114.3.1细胞复苏：从液氮中取出pbmc细胞；迅速置37℃水浴，1min内融化；用1ml移液枪将管内液体吸出，加入提前准备好的含5ml新鲜的aim-v 2％fbs培养基的15ml离心管中，1200rpm，离心5min，弃去上清，再加入1ml的dpbs重悬，计数。
115.3.2质粒孵育与电转
116.3.2.1配制电转液：取对应的lonza电转液，按核转染溶液:添加物＝82:18比例混合；
117.3.2.2从-20度冰箱取出待用的egfr car质粒融化，震荡混匀后瞬时离心，计算电转所需的量(每次电转使用6ug的egfr car质粒)，与100ul电转液混合均匀，放置5min；
118.3.2.3取12孔板，每孔加入1ml新鲜的aim-v 2％fbs培养基，摇动培养板使培养基铺满板底，将培养板放入co2培养箱培养30min；
119.3.2.4将细胞移入灭菌的1.5ml ep管中，每管加入5
×
106个细胞，3000rpm离心3min，将上清完全移除，以备电转。将100ul质粒-电转液混合液加入细胞中，放入电转仪，选取程序f1-115(人t细胞，unstin，he)，进行电转染；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培养基的十二孔板中，混匀，置于37℃，5％co2培养箱培养4-6h。
120.4激活并培养egfr car-t细胞
121.4.1抗体包被
122.电转前，从-20度冰箱取出人cd3抗体、人cd28抗体和人重组egfr抗原融化备用。在dpbs加入抗体，浓度分别为5ug/ml，混合均匀后加入六孔板，每孔1ml。对照t细胞组用人cd3抗体 人cd28抗体包被；egfr car-t细胞组使用两种不同方式包板：其一使用人egfr抗原 人cd28抗体包被，其二使用人egfr抗原 人cd28抗体 cd6抗体包被。将包被好的板放入37℃培养箱4小时以上。
123.4.2egfr car-t细胞激活
124.电转后4-6h，取出培养箱中抗体包被的六孔板，弃尽培养板中液体，加入1ml dpbs洗涤，移除dpbs，将十二孔板中电转的细胞移至抗体包被的六孔板中，每孔补加2ml aim-v 2％fbs培养基，加入适量的il-2，置于37℃，5％co2培养箱培养5天左右，其中il-2的终浓度
为500u/ml。
125.4.3egfr car-t细胞常规培养
126.egfr car-t细胞激活后，将细胞转移至无抗原包被的培养板中，使用aim-v 2％fbs 100u/ml的il-2培养基对各组t细胞进行培养，细胞培养浓度保持在每毫升5
×
105～1
×
106个细胞之间，置于37℃，5％co2培养箱培养。
127.4.4egfr car-t细胞阳性率检测
128.egfr car-t细胞电转后，传代培养到第13天时，使用流式细胞术检测t细胞中car的转染效率，具体操作步骤如下：
129.4.4.1取各组t细胞悬液加入至1.5ml的ep管，每管1
×
106个细胞；
130.4.4.2加入2μl生物素化的人egfr流式抗体，混匀，4℃避光孵育30min；
131.4.4.3加1ml pbs，室温下3000rpm，离心3min，弃去上清，重复操作1次；
132.4.4.4加入1μl pe链霉亲和素二抗流式抗体，混匀，4℃避光孵育30min；
133.4.4.5加1ml pbs，室温3000rpm离心3min，弃上清，重复操作1次；
134.4.4.6吸取400μl的pbs重悬细胞，转移至流式管中，调节流式细胞仪参数，设门选择目标细胞群，收集流式检测实验数据；
135.4.4.7使用kaluza analysis软件分析检测结果，其中图5为各组t细胞表达car的阳性率的流式检测结果；
136.4.4.8使用graphpad prism 8.0.1软件对各肿瘤细胞多次检测实验数据进行统计，图6各组t细胞表达car的阳性率多次流式检测结果统计结果。
137.上述实验结果证实，cd6抗体对zap70高表达的pbmc转染car效率无明显影响，egfr抗原 cd28抗体(egfr car-t)或egfr抗原 cd28抗体 cd6抗体(egfr car-t/cd6)激活的t细胞的转染效率均可达70％-80％(图5和图6)。但cd6抗体对zap70弱表达pbmc转染car的效率有较明显增强作用，egfr car-t/cd6组的转染效率可达60％-80％，较使用原egfr car-t组的转染效率增加20％左右(图5和图6)。
138.实施例3：不同激活方式对egfr car-t细胞增殖、活化和分化的影响
139.在发现cd6抗体作为激活剂，可明显提高zap70弱表达的pbmc的阳性率之后，进一步研究cd6抗体对zap70弱表达的pbmc制备的car-t细胞的增殖、活化和分化功能的影响。
140.1检测egfr car-t细胞的增殖情况
141.为检测转染后t细胞增殖情况，持续对电转后的t细胞生长状态进行监测，以第5天t细胞数为起始数，对培养至第5/7/9/11/12/13天的各组t细胞进行计数，计算其增殖倍数，结果如图7所示。分析发现，各组t细胞经刺激活化后在体外培养扩增过程中均长势良好，在体外培养13天可扩增32-40倍，且egfr car-t/cd6组增殖效果略优于egfr car-t组或对照t组(图7)。
142.2检测egfr car-t细胞表面活化相关的指标
143.流式细胞术检测不同激活方式活化t细胞后，培养至电转染后第11天时，以对照t组细胞为对照，收集egfr car-t组和egfr car-t/cd6组细胞并使用流式细胞术检测其表面活化指标cd137和cd107α表达情况，具体实验步骤如下：
144.2.1每组各取1
×
106个t细胞悬液加入至1.5ml的ep管；
145.2.2根据cd137或cd107α抗体推荐使用量向细胞悬液中加入cd137或cd107α流式抗
体并重悬至100ul，混匀，4℃避光孵育30min；
146.2.3向孵育抗体后的细胞悬液中加1ml的pbs，室温下3000rpm，离心3min，弃去上清，重复操作1次；
147.2.4吸取400μl的pbs重悬细胞，转移至流式管中，调节流式细胞仪参数，设门选择目标细胞群，收集流式检测实验数据；
148.2.5使用kaluza analysis软件分析检测结果，其中图8为不同t细胞表面与活化相关指标如cd137或cd107α流式检测结果；
149.2.6使用graphpad prism 8.0.1软件对各肿瘤细胞多次检测实验数据进行统计，图9和图10即为不同t细胞表面与活化相关指标如cd137和cd107α多次流式检测结果统计结果。
150.上述实验结果显示，与egfr car-t组细胞相比，egfr car-t/cd6组细胞活化状态更好，说明cd6抗体能增强t淋巴细胞的活化效率。
151.3检测egfr car-t细胞表面与t细胞分化相关的指标
152.使用流式细胞术检测egfr car-t组和egfr car-t/cd6组细胞在体外受特异性抗原刺激后中心记忆t细胞分化情况。具体实验步骤如下：
153.3.1特异性抗原刺激t细胞
154.使用特异性egfr抗原包板，分别向包被好的板中加入相同数量处于静息状态的对照t组、egfr car-t组和egfr car-t/cd6组细胞，刺激24小时后，收集各组细胞。
155.3.2使用流式细胞术检测其细胞表面cd45ro阳性细胞中cd62l和ccr7分子表达水平
156.3.2.1收集刺激后各组t细胞，每组各取1
×
106个t细胞悬液加入至1.5ml的ep管；
157.3.2.2向细胞悬液中分别加入5ul的cd45ro、cd62l和ccr7流式抗体并定容至100ul，混匀，4℃避光孵育30min；
158.3.2.3向孵育抗体后的细胞悬液中加1ml的pbs，室温下3000rpm，离心3min，弃去上清，重复操作1次；
159.3.2.4吸取400μl的pbs重悬细胞，转移至流式管中，调节流式细胞仪参数，设门选择目标细胞群，收集流式检测实验数据；
160.3.2.5使用kaluza analysis软件分析检测结果，其中图11为不同t细胞cd45ro阳性细胞中cd62l和ccr7流式检测结果。
161.上述实验结果显示，以对照t组为对照，egfr car-t和egfr car-t/cd6组细胞在受特异性抗原刺激后中心记忆性t细胞(ccr7 ,cd62l )可迅速分化为效应记忆性t细胞(ccr7-,cd62l-)(图11)，其中egfr car-t/cd6组中心记忆性t细胞表达水平更高(图11)，细胞分化水平更低，说明cd6抗体对t淋巴细胞维持低分化水平有重要作用。由上述结果综合分析可知，cd6抗体可一定水平提高t淋巴细胞增殖及活化能力，并维持其低分化水平。
162.实施例4：不同激活方式对egfr car-t细胞抗肿瘤活性的影响
163.1t细胞与不同egfr抗原表达水平的肿瘤细胞共孵育后细胞因子释放水平的检测
164.为探究egfr car-t/cd6细胞在体外的抗肿瘤效应，我们首先根据图2中检测的肿瘤表面抗原结果，选取egfr抗原高表达的panc 1肿瘤细胞株和egfr抗原低表达的hep g2肿瘤细胞株，分别与对照t、egfr car-t和egfr car-t/cd6组细胞共培养，并检测其上清中
ifn-γ分泌情况。具体操作步骤如下：
165.1.1t细胞与肿瘤细胞共孵育
166.1.1.1肿瘤细胞培养：培养肿瘤细胞株panc 1(高表达egfr抗原)和hepg2(低表达egfr抗原)，待生长状态良好，肿瘤细胞融合至80％左右，消化计数；
167.1.1.2肿瘤细胞铺板：按1
×
105个肿瘤细胞的细胞数，将panc 1或hepg2细胞均匀铺到12孔板中贴壁4个小时；
168.1.1.3加入效应细胞：分别向铺有肿瘤细胞panc 1或hepg2的孔中的分别接种1
×
105个对照t、egfr car-t和egfr car-t/cd6细胞，共培养24小时后，收集上清。
169.1.2使用多细胞因子试剂盒检测共孵育过细胞上清中细胞因子水平
170.使用细胞因子试剂盒human th1/th2 cytokine kit ii检测t细胞细胞因子表达水平，具体实验操作如下：
171.1.2.1取10μl上清于1.5ml离心管，取40μl检测稀释液(1
×
)稀释样本；
172.1.2.2按量计算并取出相应磁珠进行混合，取50μl加至样本中；
173.1.2.3取50μl抗体(humanth1/th2
-ⅱ
pe detection reagent)加至样本中，室温避光孵育3小时；
174.1.2.4取1ml洗涤缓冲液洗涤样本抗体混合液，400g离心5min，弃尽上清，取300μl洗涤缓冲液进行重悬，使用流式细胞仪收集并使用facp arrayv3分析软件对结果进行分析。
175.上述实验结果显示，egfr car-t和egfr car-t/cd6组细胞可识别egfr抗原高表达的panc 1肿瘤细胞株且分泌大量ifn-γ，但和egfr抗原低表达的hep g2肿瘤细胞株共培养时分泌ifn-γ水平极低(图12)。在t细胞电转染后添加cd6抗体作为激活剂不会影响egfr car-t细胞识别特异性肿瘤抗原的潜能。且与egfr car-t细胞相比，egfr car-t/cd6细胞分泌ifn-γ水平更高(图12)，结果表明cd6抗体作为激活剂可增强car-t细胞的抗肿瘤效应。
176.2t细胞对高表达egfr肿瘤相关性抗原的肿瘤细胞的抗肿瘤活性检测
177.我们进一步使用xcelligence rtca dp instrument(安森生物(杭州)有限公司，中国)进行实验来评估car-t细胞对高表达egfr抗原的肿瘤细胞系panc1的杀伤作用，具体实验操作如下：
178.2.1靶细胞培养：常规培养肿瘤细胞panc 1，待细胞长势良好时，消化细胞并计数；
179.2.2仪器调零：使用前向rtca电极培养板的各孔中加入50ul肿瘤细胞培养基进行调零；
180.2.3铺设靶细胞：按1
×
104个细胞/50ul的量将panc 1细胞悬液铺入rtca电极培养板的各孔中，运行仪器；
181.2.4加入效应细胞：培养肿瘤细胞24小时后暂停仪器，并向其中分别加入效靶比为1:1、2:1和4:1的对照t、egfr car-t和egfr car-t/cd6细胞，每孔各50ul，设置三个复孔，启动仪器；
182.2.5数据获取：待细胞共培养24小时后，观察细胞杀伤情况，停止程序，分析并保存数据；
183.2.6使用xcelligence rtca dp instrument对杀伤结果进行分析。
184.与空白对照组对照t相比，在低效靶比(1:1)时，两组egfr car-t细胞杀伤作用更
强，且随着效靶比的增加car-t杀伤效率明显增强。且与ifn-γ分泌的检测结果显示出一致趋势，egfr car-t/cd6细胞在一定效靶比范围内表现出比egfr car-t细胞更强的抗肿瘤效应(图13和图14)。综上所述，cd6抗体可增强car-t细胞的抗肿瘤效应。
185.最后应当说明的是，以上实施例仅仅用于说明本发明的技术方案，并不是对本发明的保护范围的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当明白在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应当视为本发明的保护范围。