用于递送治疗剂的腺相关病毒载体的制作方法

2021-10-26 19:15:00 来源：中国专利 TAG：

本申请要求于2019年2月28日提交的美国临时申请第62/812,017号；2019年4月10日提交的62/831,838；和2019年7月26日提交的62/878,865的优先权，所述文献的每一个以全文引用的方式并入本文中。序列表本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交的序列表，并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2020年6月3日，名为67000-1023_WO_SL.txt，并且大小为357,652字节。发明领域本发明一般涉及使用腺相关病毒(AAV)载体将治疗剂递送到眼睛，例如递送到角膜内皮。本发明还涉及包含AAV载体的组合物。角膜营养不良可以用本发明的方法和组合物治疗。
背景技术：
腺相关病毒(AAV)是一种小型、复制缺陷型细小病毒。AAV长为约20-24nm，密度为约1.40-1.41g/cc。AAV含有单链线性基因组DNA分子，长度为约4.7kb。单链AAV基因组DNA可以是正链，也可以是负链。AAV含有两个开放阅读框Rep和Cap，侧接两个145个碱基的反向末端重复序列(ITR)。AAV含有单个内含子。指引病毒DNA复制(Rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列含于ITR中。三个AAV启动子p5、p19和p40(以其相对图位命名)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。p5和p19是rep启动子。当与单个AAV内含子的差异剪接偶合时，两个rep启动子导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。rep蛋白具有多种酶促特性，其负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代剪接和非一致翻译起始位点负责产生三种相关衣壳蛋白。单个聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka回顾了AAV的生命周期和遗传学(Muzyczka,《微生物学和免疫学的当前主题(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,158:97-129(1992))》。AAV感染在培养细胞中是非细胞病变的。人类和其他动物的自然感染是无声的和无症状的(不引起疾病)。因为AAV会感染许多哺乳动物细胞，因此有可能在体内靶向许多不同的组织。除了分裂细胞之外，AAV还转导缓慢分裂和未分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(即染色体外元件)在这些细胞的整个生命周期内持续存在。AAV前病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得构建重组基因组具有可能性。此外，由于指引AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号都含于AAV基因组的ITR中，因此编码复制和结构衣壳蛋白(rep-cap)的基因组的大约4.3kb的部分或全部含于AAV基因组的ITR中，并且可以用异源DNA(例如含有启动子、相关DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒)替换。rep和cap蛋白可以反式提供。AAV是一种非常稳定和强大的病毒，并且可以轻松承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃维持数小时)，因此AAV的冷藏不太重要。而且，AAV感染的细胞对超级感染没有抵抗力。AAV的这些独特特性使其可用作将外源DNA递送到细胞或受试者的载体，例如在基因治疗中。角膜营养不良是局限于角膜的非炎症性双侧疾病的异质组的术语。其按病理的角膜内的解剖位置分组。大多数在角膜外没有任何表现，并且其会导致角膜混浊并影响视力(参见https://www.cornealdystrophyfoundation.org/what-is-corneal-dystrophy)。角膜具有受角膜营养不良影响的三个主要区域：角膜上皮、基质、内皮。前角膜营养不良影响角膜上皮和其基底膜以及浅表角膜基质。基质角膜营养不良影响角膜基质。后角膜营养不良影响德斯密氏膜(Descemetmembrane)和角膜内皮。最常见的后角膜营养不良是富克斯内皮角膜营养不良(Fuchsendothelialcornealdystrophy)。最近，发现某些病理病症或疾病与编码转录因子4蛋白(TCF4)的TCF4基因中的突变有关。与TCF4基因中的突变相关的疾病包括富克斯内皮角膜营养不良(FECD)、后多形性角膜营养不良(PPCD)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、皮特-霍普金斯综合征(Pitt-Hopkinssyndrome)、远端18q缺失和精神分裂症。FECD是一种导致视力问题的病症。其影响眼睛的角膜，尤其内皮。角膜位于眼睛的前表面，并且角膜组织含有五个基本层。上皮是角膜的最外层。上皮的功能是阻止异物(例如灰尘、水、细菌)进入眼睛和角膜的其他层，并提供一个光滑的表面来吸收眼泪中的氧气和细胞营养素，将这些营养分配到角膜的其余部分。上皮细胞在上皮的基底膜上锚定并组织起来。位于上皮的基底膜正下方的是鲍曼层(Bowman’slayer)，其是由胶原蛋白纤维构成的组织的透明片。在鲍曼层下面是基质。基质占角膜厚度的约90％，并且主要由水和胶原蛋白组成。德斯密氏膜是一层薄而结实的组织，位于基质下方。德斯密氏膜由胶原蛋白纤维构成，并且由位于其下方的内皮细胞制成。内皮是德斯密氏层之下的层。内皮是角膜极薄的最内层，并且对于保持角膜清洁至关重要。角膜内皮是单层无丝分裂细胞，其在角膜基质与房水之间形成屏障。角膜内皮细胞通过从角膜泵出液体来维持角膜的正确厚度以保持透明度来起作用。在一些后角膜营养不良(例如FECD)中，角膜内皮病变，并且细胞在这种进行性疾病的过程中死亡。随着这些细胞死亡，剩余的细胞会膨胀以填充空间，并且所述层失去正常起作用的能力。这导致角膜水肿和不透明度增加，导致视力下降。在疾病的晚期阶段，可能会导致失明。由于FECD所致的视力丧失是美国角膜移植的主要原因。由于角膜内皮在这些疾病中受到影响，所以针对其进行治疗可能有助于阻止疾病的发展。一种这样的方法是腺相关病毒(AAV)，其可以被包装以递送治疗剂，并且经由前房内或基质内注射与角膜内皮接触。蛋白质或核苷酸序列通常被包装到AAV载体中。有人提出遗传因子与FECD的发生有关。已知与FECD相关的基因座包括FCD1至FCD4、ZEB1/TCF8、SLC4A11、LOXHD1和COL8A2。一种这样的遗传因子是转录因子4(TCF4)基因中的三核苷酸重复序列(TNR)扩增。大多数FECD的遗传易感性与TCF4基因的第三个内含子中的TNR相关。大于50个重复序列的重复序列长度通常与FECD的临床诊断相关(Wieben等人,PLOSOne,7:11,e49083(2012))。最近，有人提出这种TNR扩增会导致受影响的TCF4RNA聚集，并且螯合关键RNA剪接因子(Mootha,等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,55(1):33-42(2014)；Mootha,等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,56(3):2003-11(2015)；Vasanth,等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,56(8):4531-6(2015)；Soliman等人,JAMAOphthalmol.,133(12):1386-91(2015))。RNA剪接因子的螯合可导致基因表达的整体变化，从而导致细胞功能的显著变化和细胞死亡(Du等人,J.Biol.Chem.,290:10,5979-5990(2015))。与FECD相关的另一个基因突变发生在COL8A2基因中(Vedana等人,《临床眼科学(ClinicalOpththalmology)》,10,321-330(2016))。胶原蛋白VIII或COL8(包含COL8A1和COL8A2)有规律地分布在角膜的德斯密氏膜中。已表明，来自具有COL8A2中的突变的患者的角膜以不协调的方式具有不同数量的COL8A1和COL8A2的不规则镶嵌沉积。COL8A2的三个点突变导致突变COL8肽的细胞内积累。这些点突变是Gln455Lys、Gln455Val和Leu450Trp。突变COL8肽的细胞内积累可导致早发型FECD，以及相关的角膜病症PPCD(其特征是角膜的德斯密氏膜和内皮层的变化)。尽管AAV载体已被用于将基因编辑疗法直接递送到眼睛，但这通常仅用于眼睛的后部，例如视网膜。对将基因编辑疗法递送到眼睛的前部(例如角膜)的研究和记录要少得多。仍然需要开发能够优先将治疗剂仅递送到眼睛的特定区域和特定组织或细胞，特别是前部(例如角膜)的递送技术。技术实现要素：本发明提供一种向角膜内皮递送治疗剂以治疗例如角膜营养不良的疾病，例如FECD的方法。本发明的方法利用AAV将治疗剂直接递送到眼睛，尤其角膜内皮。在某些实施例中，AAV与蛋白质或编码蛋白质的核苷酸一起包装，以在眼睛的某些细胞中表达。在其他实施例中，AAV用CRISPRRNP复合物(即具有Cas蛋白的复合物)包装以在眼睛中和眼睛的特定区域或细胞中引发定向基因编辑。在一些实施例中，AAV用与编码Cas蛋白的核苷酸序列复合的CRISPRgRNA包装。本发明还提供包含AAV的组合物。在一个特定方面，本发明提供一种组合物，其包含：a)AAV载体的核苷酸序列或其部分；和b)核酸编辑系统，其包含：至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列与角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因互补；核酸，其能够下调与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因的基因表达；和/或至少一个核苷酸序列或其部分，所述至少一个核苷酸序列或其部分编码待在眼睛中表达的蛋白质。在另一方面，本发明提供一种在有需要的受试者的眼睛中表达蛋白质的方法，其包含：a)提供一种或多种包含编码所述蛋白质的核苷酸序列的腺相关(AAV)载体；和b)将所述AAV载体施用于所述眼睛。在另一方面，本发明提供一种用于修复有需要的受试者的角膜中所表达的基因的方法，所述方法包含：a)提供一种包含核酸编辑系统的递送系统，所述核酸编辑系统包含至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列与角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因互补；和b)将所述递送系统施用于所述受试者的角膜。当使用术语“修复”时，其还意味包括诱导修复。在又一方面，本发明提供一种治疗有需要的受试者的由包含三核苷酸重复序列(TNR)和/或点突变的基因的突变等位基因引起的角膜的疾病或病症的方法，所述方法包含：a)切除所述基因内的所述三核苷酸重复序列(TNR)的至少一部分，其包含：i)提供AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，其包含编码一个或多个引导RNA的一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个引导RNA靶向所述TNR内的序列、所述TNR的5'、所述TNR的3'或其组合；和ii)将所述载体施用于所述角膜；和/或b)校正所述基因或基因产物的点突变，其包含：i)提供包含一个或多个核苷酸序列的AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，所述一个或多个核苷酸序列编码一个或多个引导RNA，所述一个或多个引导RNA靶向与基因产物中的点突变相关的基因中的序列；和ii)将所述载体施用于所述角膜；其中在前房内注射之后，所述一个或多个核苷酸序列优先在所述角膜中表达。在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的受试者的由包含三核苷酸重复序列(TNR)和/或点突变的基因的突变等位基因引起的角膜的疾病或病症的方法，所述方法包含：a)切除所述基因内的所述三核苷酸重复序列(TNR)的至少一部分，其包含：i)提供AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，其包含编码一个或多个引导RNA的一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个引导RNA靶向所述TNR内的序列、所述TNR的5'、所述TNR的3'或其组合；和ii)将所述载体施用于所述角膜；和/或b)校正所述基因或基因产物的点突变，其包含：i)提供包含一个或多个核苷酸序列的AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，所述一个或多个核苷酸序列编码一个或多个引导RNA，所述一个或多个引导RNA靶向与基因产物中的点突变相关的基因中的序列；和ii)将所述载体施用于所述角膜。在另一方面，本发明提供一种下调在有需要的受试者中的角膜基因的表达的方法，所述方法包含向所述受试者施用递送系统，所述递送系统包含：a)AAV载体的核苷酸序列或其部分；b)能够下调与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因的基因表达的核酸；和c)将所述递送系统施用于所述受试者的角膜。在另一方面，本发明提供一种在有需要的受试者的角膜的内皮细胞中表达蛋白质的方法，其包含：a)提供一种或多种包含编码所述蛋白质的核苷酸序列或其部分的腺相关(AAV)载体；和b)将所述AAV载体施用于所述角膜。本发明的这些和其他目的、优点和特征对本领域技术人员来说在阅读如下更充分描述的组合物和方法的细节后将变得显而易见。附图说明图1：图1是角膜层的图示(参见https://discoveryeye.org/treatment-corneal-scratches-and-abrasions/)。图2：图2是小鼠眼睛结构的图示，以及对注射至眼睛中的前房内和玻璃体内的描绘。图3：图3描绘了前房内递送AAV5-eGFP后小鼠眼睛的体内图像。图A至图D示出了OD眼睛的图像(“OD”指OculusDexter，拉丁语中的右眼)。图E至图H示出了来自OS眼睛的图像(“OS”指OculusSinister，拉丁语中的左眼)。图A为图B提供了参考。图E为图F提供了参考。图B&图F示出的图像表明了来自AAV5-eGFP的角膜中的荧光。图C&图G示出了眼底图像，并且图D&图H示出的图像表明了视网膜中没有荧光。OS视网膜中检测到的两个荧光点由图H中的箭头示出。图4：图4描绘了图3所示出的同一只眼睛的免疫组织化学。AAV5-eGFP由前房内注射递送。OS眼睛被分为角膜平面安装件(图A，图B中示出的经放大的插件)和视网膜平面安装件(图C，图D中示出的经放大的插件)。染色示出eGFP定位至角膜内皮，并且少数细胞在视网膜中染色。图E所示出的整体采集OD眼，并针对横截面进行处理。染色示出eGFP定位至角膜内皮，并且不是在视网膜中。经放大的插件示出在图F至图G中。图F示出了角膜内皮层。图G示出了视网膜，其中必须增加曝光时间以捕获图E中看不到的阳性信号。(绿色＝内源性eGFP，红色＝使用eGFP第一抗体进行二次染色)。图5：图5描绘了前房内递送AAV6-eGFP后小鼠眼睛的体内图像。图A为图B提供了参考。图B示出的图像表明了来自AAV6-eGFP的角膜中的荧光。图C示出了眼底图像，并且图D示出的图像表明了视网膜中的荧光。图6：图6描绘了图5所示出的同一只小鼠眼睛的免疫组织化学。染色表明AAV6-eGFP存在于角膜内皮、基质和睫状体中(绿色＝内源性eGFP，红色＝使用eGFP第一抗体进行二次染色，蓝色＝DAPI染色后的细胞核)。图A中的白色矩形指示图B中示出的放大区域。图B中的左箭头指示阳性角膜基质层。图B图中的右箭头指示阳性角膜内皮层。图7：图7描绘了前房内递送AAV8-eGFP后小鼠眼睛的体内图像。图A为图B提供了参考。图B示出的图像表明了来自AAV8-eGFP的角膜中的荧光。图C示出了眼底图像，并且图D示出的图像表明了视网膜中的荧光。图8：图8描绘了图7所示出的同一只小鼠眼睛的免疫组织化学。染色表明AAV8-eGFP存在于角膜内皮、基质和睫状体中(绿色＝内源性eGFP，红色＝使用eGFP第一抗体进行二次染色，蓝色＝DAPI染色后的细胞核)。图A中的白色矩形指示图B中示出的放大区域。图B中的左箭头指示阳性角膜基质层。图B图中的右箭头指示阳性角膜内皮层。图9：图9描绘了来自4只小鼠(全眼)的针对AAV血清型中的每一种的eGFP蛋白水平的ELISA结果，如通过前房内途径递送的AAV5-eGFP、AAV6-eGFP、AAV8-eGFP。包含接受PBS 0.001％普朗尼克酸的两只小鼠以作为已测试的AAV血清型中的每一种的对照。示出了具有SEM的方式。图10：图10是合成图，描绘了在IC递送至小鼠眼睛中后，AAV2-eGFP、AAV5-eGFP、AAV6-eGFP、AAV8-eGFP和AAV9-eGFP的体内i荧光图像和免疫化学结果。具体实施方式应理解，前述一般描述和以下详细描述仅仅是示例性和说明性的，并不限制所要求保护的任何主题。标题仅用于组织目的，并不旨在以任何方式限制本发明。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另有说明，否则所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、网站和其他公开的材料在本文的整个公开中提及，出于任何目的通过引用整体并入。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是描述优选的方法。角膜营养不良是局限于角膜的非炎症性双侧疾病的异质组的术语。其按角膜内病理的解剖位置分组。大多数在角膜外没有任何表现，并且其会导致角膜混浊并影响视力(参见https://www.cornealdystrophyfoundation.org/what-is-corneal-dystrophy)。前角膜营养不良影响角膜上皮和其基底膜以及浅表角膜基质。基质角膜营养不良影响角膜基质。后角膜营养不良影响德斯密氏膜和角膜内皮。最常见的后角膜营养不良是富克斯内皮角膜营养不良。角膜具有受角膜营养不良影响的三个主要区域：角膜上皮、基质和内皮。AAV5在IC递送后靶向角膜内皮，并且可用于为后角膜营养不良递送基因疗法。AAV6和AAV8都可在IC递送后靶向角膜基质、内皮和睫状体，并且可用于为角膜基质营养不良和后角膜营养不良递送基因治疗。由于一些前角膜营养不良会影响上皮和浅表角膜基质，因此AAV6和AAV8可以为基质提供基因治疗。表D1显示角膜营养不良和与其相关的某些基因((Klintworth,2009.《角膜营养不良(Cornealdystrophies)》.OrphanetJ.RareDis.,4,7.doi:10.1186/1750-1172-4-7)。表D1.角膜营养不良的概述：遗传模式、基因座、基因和国际角膜营养不良分类委员会(IC3D)的类别。*第1类：定义明确的角膜营养不良，其中基因已被定位和鉴定，并且已知特定突变。第2类：明确定义的角膜营养不良，其已定位到1个或多个特定染色体位点，但基因仍有待鉴定。第3类：定义明确的角膜营养不良，其中病症尚未被定位到染色体位点。第4类：疑似新的或先前记录的角膜营养不良，尽管其作为一个独特的实体的证据尚不令人信服。表D2来自Moore,C.B.T.,Christie,K.A.,Marshall,J.,&Nesbit,M.A.(2018)。个性化基因组编辑——角膜营养不良的未来。《视网膜与眼科研究进展(ProgRetinEyeRes)》,65,147-165.doi:10.1016/j.preteyeres.2018.01.004。表D2.已知角膜营养不良的列表，包括相关遗传模式、基因座和致病基因。例如通过前房内注射将AAV直接递送到眼睛可导致病毒靶向角膜的趋向性。经由前房内注射递送AAV5导致病毒靶向角膜内皮而非其他眼部结构的趋向性。这种靶向趋向性可以将治疗剂递送到受影响的结构，同时保留其他眼部结构，降低脱靶效应的风险。AAV6或AAV8的前房内递送也表明靶向角膜内皮。然而，当使用十分普遍的CAG启动子递送基因时，AAV6和AAV8也显示出对其他角膜和前部结构以及视网膜的趋向性。AAV是一种小型病毒，由两个开放阅读框Rep和Cap组成，侧接两个145个碱基的反向末端重复序列(ITR)。当用于基因治疗时，Rep和Cap开放阅读框被移除，并且所期望基因与驱动所期望基因转录的启动子一起插入ITR之间。CRISPR核苷酸(例如gRNA和/或编码Cas蛋白的核苷酸)可以包装在ITR之间，从而形成用于针对性递送治疗剂的病毒载体。在一些实施例中，CRISPR核苷酸gRNA用Cas蛋白(例如Cas9核酸酶)包装以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。然而，AAV也可以用编码其他蛋白质的核苷酸包装。AAV是优选病毒载体，因为其可以感染分裂和未分裂细胞，并且与缺乏致病性有关。因此，AAV载体可用于优先靶向角膜的某些层。举例来说，AAV5专门靶向角膜内皮。AAV载体的特异性降低了经由AAV载体递送的治疗剂的脱靶效应的风险。在某些实施例中，AAV载体可包含与靶基因上的至少一个靶序列互补的一个或多个核苷酸序列。在一些实施例中，AAV载体可包含一种或多种核苷酸编辑系统。核苷酸编辑系统包括但不限于CRISPR系统、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或安塔够妙RNA(antagomirRNA)。在某些实施例中，通过将一种或多种核苷酸编辑系统直接递送到眼睛，AAV载体可用于眼睛，优选为角膜或其他受影响的前部结构中的靶向基因编辑或疗法。在某些实施例中，AAV载体可用于角膜中的靶向基因疗法，通过递送靶向涉及角膜营养不良(例如富克斯内皮角膜营养不良(FECD))的基因的CRISPR复合物。FECD与转录因子4(TCF4)基因中的三核苷酸重复序列(TNR)扩增有关。大多数FECD的遗传易感性与TCF4基因的第三个内含子中的TNR相关。FECD是一种影响眼睛的角膜，尤其是内皮的病症。角膜营养不良也与COL8A基因中的突变有关。COL8A基因的突变导致基因产物中的Gln455Lys、Gln455Val或Leu450Trp突变。通过将CRISPR复合物(gRNA加上Cas蛋白或编码Cas蛋白的核苷酸)递送到角膜内皮，TNR或其一部分可以从角膜内皮中的TCF4基因中切除，而不影响眼睛的其他部位中的TCF4基因。在某些实施例中，CRISPR复合物被包装到一个或多个AAV载体中。CRISPR复合物可以靶向TCF4基因的TNR，或COL8A2基因的突变等位基因。在某些实施例中，AAV载体可以自己递送。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。定义在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”和“所述”也旨在包括复数形式。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意味“和/或”。如本文所用，术语“包含”指定所陈述特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征的存在或添加、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其群组。此外，如果在详细说明或权利要求中使用术语“包括”、“具有”、“组成”、“包含”或其变体，那么这类术语旨在以类似于术语“包含”的方式包括在内。如本文所用，范围和数量可以表示为“约”特定值或范围。“约”还旨在包括确切数量。因此，“约5％”意味“约5％”以及“5％”。“约”意味在预期应用或目的的典型实验误差范围内。如本文所用，“治疗”是指针对疾病或病症的治疗剂的任何递送、施用或应用。治疗可包括治愈疾病、抑制疾病、减缓或停止疾病的发展、改善疾病的一种或多种症状或预防疾病的一种或多种症状的复发。如本文所用，“FECD”是指富克斯角膜内皮营养不良。FECD包括患有病症的患者，以及没有症状但具有FECD遗传倾向的受试者。如本文所用，“AAV”是指腺相关病毒。AAV是一种无包膜病毒，呈二十面体，长为约20到24nm，密度为约1.40-1.41g/cc，并且含有长度为大约4.7kb的单链线性基因组DNA分子。单链AAV基因组DNA可以是正链，也可以是负链。在某些实施例中，术语“AAV”或“AAV载体”是指已被修饰以使得例如CRISPR复合物的治疗剂替代AAV基因组的反向末端重复序列(ITR)之间的Rep和Cap开放阅读框。如本文所用，“AAV血清型”意味可通过血清学或DNA测序方法识别并可通过其抗原特征区分的AAV的细分。如本文所用，“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送到细胞内部的物质的组合物。载体包括但不限于线性聚核苷酸、与离子或两亲化合物相关的聚核苷酸、质粒和病毒。术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。“载体”还可包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物脂质体、脂质纳米颗粒、非脂质纳米颗粒等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。优选地，载体是AAV载体。如本文所用，“RNA”是指包含一个或多个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是在β-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成RNA和重组产生的RNA。术语“RNA”还指通过一个或多个核苷酸(例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸)的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。如本文所用，“抑制性RNA”意味含有与介导靶核酸的水平或活性降低的靶核酸互补的序列的核酸分子。抑制性RNA包括但不限于干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核酶、安塔够妙和反义寡核苷酸。如本文所用，“shRNA”是指包含反义区、环部分和有义区的RNA分子，其中有义区具有与反义区碱基配对以形成双链体茎的互补核苷酸。在转录后加工之后，shRNA通过由RNaseIII家族成员Dicer介导的裂解转化为siRNA。如本文所用，“siRNA”是指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰来抑制或下调基因表达的任何小RNA分子。如本文所用，“反义RNA”或“反义寡核苷酸”是短的、合成的核酸片段，其序列与编码蛋白质的mRNA互补。反义RNA与mRNA结合并阻止转录。如本文所用，“安塔够妙”或“安塔够妙RNA”是指与特定微RNA(miRNA)靶标互补的小的合成RNA，任选地在裂解位点处错配或一个或多个碱基修饰以抑制裂解。如本文所用，“微RNA”或“miRNA”是指长度为约21-23个核苷酸的单链RNA分子，其调节基因表达。miRNA分子与一种或多种mRNA部分互补，并且其主要功能是下调基因表达。如本文所用，“TNR”是指三核苷酸重复序列(即三个碱基对的多次重复)。术语“TNR扩增”是指高于正常数量的TNR。举例而言，TCF4的内含子3中约50个或更多个TNR将被视为TNR扩增。如本文所用，“CRISPR”意味称为成簇的、规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR)的细菌适应性免疫系统。如本文所用，“引导RNA”和“gRNA”可互换使用，并且指针对靶DNA序列的RNA序列。gRNA含有CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(trRNA或tracrRNA)。crRNA和trRNA可以与单个RNA分子，称为单引导RNA(sgRNA)相关联。或者，crRNA和trRNA可以在单独的RNA分子上分离，并形成双引导RNA(dgRNA)。在一些实施例中，gRNA被化学修饰，并且包含一种或多种修饰的核苷或核苷酸。核苷和核苷酸的修饰可包括以下一者或多者：i)改变，例如置换磷酸二酯主链中的一个或两个非连接磷酸氧和/或一个或多个连接磷酸氧；ii)改变，例如置换核糖的成分，例如核糖上的2'-羟基；iii)用“脱磷”连接子完全取代磷酸部分；iv)修饰或置换天然存在的核碱基，包括用非规范核碱基；v)置换或修饰核糖-磷酸骨架；vi)修饰寡核苷酸的3'端或5'端，例如去除、修饰或置换末端磷酸基团，或结合部分、帽或连接子；和vii)修饰或置换糖。如本文所用，“引导序列”是指crRNA或trRNA内与靶序列互补的约20个碱基对的序列。引导序列将gRNA指引到靶序列以用于用核酸酶裂解。如本文所用，“靶序列”是指受试者的基因组DNA内的核酸序列，gRNA将核酸酶指引到所述序列以用于裂解靶序列。举例而言，Cas蛋白可以被gRNA指引到靶序列，其中gRNA与靶序列杂交，并且核酸酶裂解靶序列。靶序列包括DNA的正链和负链(即序列和序列的反向互补链)。在一些实施例中，当引导序列是靶序列的反向互补序列时，引导序列可以与靶序列的前20个核苷酸相同。如本文所用，“靶序列”或“靶位点”还指基因组核酸序列，其定义了在足以发生结合的条件下结合分子可特异性结合的核酸的一部分。如本文所用，术语“CRISPR复合物”是指gRNA和编码Cas蛋白的内核苷酸的组合(gRNA:Cas内核苷酸)，或gRNA和Cas蛋白的组合(gRNA:Cas蛋白)。如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)是指gRNA:Cas蛋白复合物。本发明的CRISPR复合物可针对并裂解TCF4基因的TNR内或侧接TNR(5'或3')的靶序列。CRISPR复合物还可以针对裂解COL8A基因中的靶序列。如本文所用，“前间隔序列邻近基序(protospaceradjacentmotif)”或“PAM”是指必须与靶核苷酸序列邻近的核苷酸序列。所需PAM取决于所使用的特定CRISPR系统。举例而言，在源自化脓性链球菌(Streptococcuspyogene)的CRISPR/Cas系统中，靶DNA必须紧跟在5'-NGGPAM之前(其中“N”是任何核碱基，后跟两个鸟嘌呤核碱基)以实现最佳切割。尽管化脓性链球菌Cas9也识别5'-NAGPAM，但其似乎在这些PAM位点切割效率较低。其他Cas9直系同源物(例如，源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))需要不同的PAM序列。如本文所使用的，“插入缺失(indel)”意指插入突变/缺失突变，由在DNA核酸中的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的许多核苷酸组成。如本文所使用的，“切除片段(excisionfragment)”或“切除片段(excisionfragments)”是指当两个或更多个gRNA与CasmRNA或Cas蛋白一起使用时可能发生的连续数量的核苷酸(如TNR)的缺失。如本文所使用的，“启动子”意指由细胞的合成机制识别的或经引入的合成机制识别的、启动多核苷酸序列特异性转录所需的DNA序列。优选的是可操作以用于AAV载体的启动子，优选地AAV5、AAV6和/或AAV8，以及组织特异性启动子，优选地对眼睛特异，更优选地对角膜特异，并且最优选地对角膜内皮特异。例如，AAV启动子包含AAVp5启动子。启动子包括但不限于CAG、SYN1、CMV、NSE、CBA、PDGF、SV40、RSV、LTR、SV40、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK、EF1α、GRK、MT、MMTV、TY、RU486、RHO、RHOK、CBA、嵌合CMV-CBA、MLP、RSV、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段等。在用异源DNA包装的AAV中，可以使用通常与异源核酸相关的启动子，或可以使用通常与AAV载体相关的启动子，或通常不与两者相关的启动子。如本文所使用的，“组成型启动子”是核苷酸序列，当该核苷酸序列与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大部分或全部生理条件下导致基因产物在细胞中产生。组成型启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段或其组合。如本文所使用的，“诱导型启动子”是核苷酸序列，当该核苷酸序列与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才导致基因产物在细胞中基本上产生。诱导型启动子的实例包括，但不限于，由热激、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的启动子。在一些实施例中，启动子可以是组织特异性的，如在角膜，例如角膜上皮中特异表达的启动子。如本文所使用的，“组织特异性启动子”是核苷酸序列，当该核苷酸序列与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，才导致基因产物在细胞中基本上产生。组织特异性启动子包括但不限于CMV、CBA、RHO、以及RHOK。如本文所使用的，“启动子/调节序列”意指与启动子/调节序列可操作地连接的基因产物表达所需的核酸序列。此序列可以是核心启动子序列，或该序列也可以包含增强子序列和基因产物表达所需的其他调节元件。如本文所使用的，“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和朝向，以控制由RNA聚合酶启动的转录和多核苷酸的表达。这些包含启动子，3’UTR或5’UTR。启动子可以被RNA聚合酶III(PolIII)识别，如但不限于U6PolIII启动子和H1PolIII启动子。PolIII启动子可以是例如，小鼠或人类。如本文所使用的，“基因编辑”或“核酸编辑”是指靶基因的核酸序列的修饰。如本文所使用的，“核酸编辑系统”或“基因编辑系统”是指可用于进行基因编辑或核酸编辑的方法。核酸编辑系统和基因编辑系统包含CRISPR系统和干扰RNA。如本文所使用的，“递送系统”是指用于将核酸递送至靶细胞的材料。此类材料可以包含病毒载体，如AAV载体和药学上可接受的成分。如本文所使用的，“调节”或“修饰”包含减少或抑制例如，基因或蛋白质的表达或功能，以及增加例如，基因或蛋白质的表达或功能。如本文所使用的，“调节”或“修饰”也包含基因功能的完全恢复，这包含用野生型版本替换基因的一个或多个突变部分或替换突变基因。如本文所使用的，“下调(down-regulating)”或“下调(down-regulation)”是指靶核苷酸序列表达或转录的减少。下调可以是靶核苷酸序列表达或转录的部分或暂时减少。下调可以是靶核苷酸序列的表达或转录的完全消除。如本文所使用的，“敲低”是指靶核苷酸序列表达或转录的部分或暂时减少。这可以通过施用与靶序列结合的互补核苷酸序列来实现。敲低可以由反义寡核苷酸、siRNA等引发。如本文所使用的，“敲除”是指靶核苷酸序列的表达或转录的完全消除。敲除可以通过例如使用CRISPR系统将靶核苷酸序列从靶基因中切割出来来引发。如本文所使用的，非同源末端接合(NHEJ)是DNA修复机制，该修复机制是切割靶核苷酸序列后断裂末端的重新连接。如本文所使用的，“同源修复/同源定向修复(HR/HDR)”是指DNA修复，该修复是同源重组的过程，其中使用DNA模板来提供双链断裂的精确修复所需的同源性。修复可由插入所期望序列或修饰靶序列组成。如本文所使用的，“修复模板”是指在HR/HDR中使用的DNA模板。如本文所用，“受试者”是指活的有机体。优选地，受试者是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿动物或伴侣动物，例如狗、猫、牛、猪等。基因表达的调节基因表达可以通过给有需要的受试者施用包括核苷酸编辑系统的组合物来调节。在一个实施例中，靶基因表达的调节包括给受试者施用组合物，其中该组合物包括核酸编辑系统，该系统包括与角膜营养不良相关的靶基因上的至少一个等位基因互补的至少一个核苷酸序列。在某些实施例中，与靶基因上的至少一个等位基因互补的至少一个核苷酸序列选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或反义RNA。组合物的施用在某些实施例中，组合物是自行施用的。在优选的实施例中，组合物包括腺相关病毒(AAV)载体，或编码AAV载体的核苷酸序列或其部分。AAV腺相关病毒(AAV)是一种小型、复制缺陷型细小病毒。AAV长为约20-24nm，密度为约1.40-1.41g/cc。AAV含有单链线性基因组DNA分子，长度为约4.7kb。单链AAV基因组DNA可以是正链，也可以是负链。AAV含有两个开放阅读框Rep和Cap，侧接两个145个碱基的反向末端重复序列(ITR)。AAV含有单个内含子。指引病毒DNA复制(Rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列含于ITR中。三个AAV启动子p5、p19和p40(以其相对图位命名)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。p5和p19是rep启动子。当与单个AAV内含子的差异剪接偶合时，两个rep启动子导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。rep蛋白具有多种酶促特性，其负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代剪接和非一致翻译起始位点负责产生三种相关衣壳蛋白。单个聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka回顾了AAV的生命周期和遗传学(Muzyczka,《微生物学和免疫学的当前主题(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,158:97-129(1992))》。AAV感染在培养细胞中是非细胞病变的。人类和其他动物的自然感染是无声的和无症状的(不引起疾病)。因为AAV会感染许多哺乳动物细胞，因此有可能在体内靶向许多不同的组织。除了分裂细胞之外，AAV还转导缓慢分裂和未分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(即染色体外元件)在这些细胞的整个生命周期内持续存在。AAV前病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得构建重组基因组具有可能性。此外，由于指引AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号都含于AAV基因组的ITR中，因此编码复制和结构衣壳蛋白(rep-cap)的基因组的大约4.3kb的部分或全部含于AAV基因组的ITR中，并且可以用异源DNA(例如含有启动子、相关DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒)替换。rep和cap蛋白可以反式提供。已经鉴定了几种AAV血清型，其趋向性(其感染的细胞类型)不同。血清型AAV1对以下组织示出趋向性：CNS；心脏；视网膜色素上皮细胞(RPE)；和骨骼肌。血清型AAV2对以下组织示出趋向性：CNS；肾脏；感光细胞；和RPE。血清型AAV3主要对心脏和肝脏示出趋向性。血清型AAV4对以下组织示出趋向性：CNS；肺；和RPE。血清型AAV5对以下组织示出趋向性：CNS；肺；感光细胞；和RPE。血清型AAV6对以下组织示出趋向性：肺；和骨骼肌。血清型AAV7对以下组织示出趋向性：肝脏；和骨骼肌。血清型AAV8对以下组织示出趋向性：CNS；心脏；肝脏；胰腺；感光细胞；RPE；和骨骼肌。血清型AAV9对以下组织示出趋向性：CNS；心脏；肝脏；肺；和骨骼肌。AAV病毒的趋向性可能与衣壳蛋白氨基酸序列的可变性有关，该衣壳蛋白可能与不同类型细胞上存在的不同功能受体结合。根据异源DNA盒中包含的启动子，有可能靶向眼睛中的特异性组织。衣壳蛋白的修饰也可能实现某些组织或细胞的特异性感染性。在一个实施例中，含有Anc80或Anc80L65衣壳蛋白的AAV用于将治疗剂直接递送至眼睛中的特异性组织。在一些实施例中，AAV病毒颗粒包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如，野生型AAV6衣壳，或变体AAV6衣壳，如ShH10，如U.S.PGPub2012/0164106中所描述的)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如，野生型AAV9衣壳或经修饰的AAV9衣壳，如U.S.PGPub2013/0323226中所描述的)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪氨酸衣壳突变体、肝素结合衣壳突变体、AAV2R471A衣壳、AAVAAV2/2-7m8衣壳、AAVDJ衣壳(例如，AAV-DJ/8衣壳、AAV-DJ/9衣壳，或U.S.PGPub2012/0066783中描述的衣壳。中的任何其他衣壳)、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛类AAV衣壳、小鼠AAV衣壳、rAAV2/HBoV1衣壳，或U.S.Pat.No8,283,151或国际公开号WO2003/042397中描述的AAV衣壳。在一些实施例中，AAV病毒颗粒包括AAV衣壳，该衣壳包括基于AAV2的VP1编号的位置R484、位置R487、位置K527、位置K532、位置R585或位置R588中的一个或多个的氨基酸取代。在进一步的实施例中，AAV颗粒包括来自类别A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施例中，rAAV病毒颗粒包括AAV血清型2衣壳。在进一步的实施例中，AAV血清型2衣壳包括AAV2衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括相对于AAV2VP1编号的R471A氨基酸取代。在一些实施例中，载体包括AAV1血清型反向末端重复(ITR)、AAV2血清型反向末端重复(ITR)、AAV3血清型反向末端重复(ITR)、AAV4血清型反向末端重复(ITR)、AAV5血清型反向末端重复(ITR)、AAV6血清型反向末端重复(ITR)、AAV7血清型反向末端重复(ITR)、AAV8血清型反向末端重复(ITR)、AAVrh8血清型反向末端重复(ITR)、AAVrh8R血清型反向末端重复(ITR)、AAV9血清型反向末端重复(ITR)、AAV10血清型反向末端重复(ITR)、AAVrh10血清型反向末端重复(ITR)、AAV11血清型反向末端重复(ITR)、AAV12血清型反向末端重复(ITR)、AAV2R471A血清型反向末端重复(ITR)、AAVDJ血清型反向末端重复(ITR)、山羊AAV血清型反向末端重复(ITR)、牛类AAV血清型反向末端重复(ITR)或小鼠AAV血清型反向末端重复(ITR)。在一些实施例中，载体包括AAV血清型2ITR。在一些实施例中，AAV病毒颗粒包括一种或多种源自相同AAV血清型的ITR和衣壳。在其他实施例中，AAV病毒颗粒包括一种或多种源自不同于rAAV病毒颗粒衣壳的AAV血清型的ITR。在一些实施例中，rAAV病毒颗粒包括AAV2衣壳，并且其中载体包括AAV2ITR。在进一步的实施例中，AAV2衣壳包括AAV2衣壳蛋白，该衣壳蛋白包括相对于AAV2VP1编号的R471A氨基酸取代(参见美国专利公开2017/0304465)。最近已经示出，在AAV5载体中包含人类视紫红质激酶(hGRK1)启动子导致灵长类动物视网膜中的杆和锥特异性表达(Boye等人,《人类基因疗法(HumanGeneTherapy)》,23:1101-1115(2012年10月)(DOI:10.1089/hum.2012.125))。最近还已经示出，具有改变的衣壳蛋白的AAV病毒体可能赋予更大的组织特异性感染性。例如，与野生型AAV衣壳蛋白相比，具有变体衣壳蛋白的AAV6示出视网膜细胞的增加的感染性(US8,663,624)。与野生型AAV相比，包括对应于AAV2VP1氨基酸570和611的两个相邻氨基酸之间的肽插入的变体衣壳蛋白，或另外的AAV血清型衣壳蛋白中的相应位置，赋予视网膜细胞增加的感染性(US9,193,956)。蛋白质在角膜中的表达为了在角膜中表达特异性蛋白质，可以将用编码所期望蛋白的内核苷酸包装的AAV载体或用所期望蛋白包装的AAV载体直接递送或施用于眼睛。蛋白质可以包含，例如，CRISPR相关(Cas)蛋白，或标志物蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP或eGFP))。在某些实施例中，AAV载体可以被递送而不被封闭在任何颗粒或脂质血管中。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。在一些实施例中，组合物和/或AAV载体可以直接递送至眼睛。可以将组合物和/或AAV载体施用至眼睛的前房、眼睛的后房、角膜或眼睛的玻璃状房。在优选的实施例中，AAV载体直接施用于与角膜接触的前房的房水。如双AAV载体系统等多于一个的AAV载体可以用于调节基因表达的目的，如本发明所定义的。如以上所解释的，存在若干AAV血清型，每种都对某些类型的组织表现出趋向性。尽管所使用的AAV血清型没有特别限制，但AAV5血清型、AAV6血清型和AAV8血清型是优选的AAV载体，用于靶向眼睛中的角膜和前部组织。为了测试本发明中不同AAV血清型的病毒趋向性，用编码绿色荧光蛋白(GFP或eGFP)的核苷酸序列包装若干血清型。这些AAV-eGFP复合物皮下注射递送至眼睛中。GFP的荧光可以在体内测量，示出AAV-GFP的定位。GFP的定位也可以通过对眼睛的区段进行免疫组织化学来评估。如由免疫组织化学染色所指示的，AAV5的病毒趋向性定位于角膜内皮。AAV6的病毒趋向性定位于角膜内皮、基质和内皮以及睫状体，其中部分靶向视网膜细胞。AAV8的病毒趋向性定位于角膜内皮、和基质以及睫状体，其中部分靶向视网膜细胞。在IC施用后，AAV2和AAV9的病毒趋向性定位于眼睛的后区段和前区段两者，其中后区段的表达大于前区段。结果示出，AAV5、AAV6和AAV8对角膜组织示出选择性趋向性。当期望选择性靶向角膜内皮时，优选使用AAV5。使用组织选择性较低的其他AAV血清型(例如，AAV2)可能会导致不必要的非靶向效应。在某些实施例中，AAV载体可以自己递送。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。在一些实施例中，AAV载体可以直接递送到眼睛。可以将AAV载体施用至眼睛的前房、眼睛的后房、角膜或眼睛的玻璃状房。在某些实施例中，可以将AAV载体施用于角膜基质、角膜缘、角膜上皮表面上或角膜内皮膜上。在优选的实施例中，AAV载体直接施用于与角膜内皮直接接触的前房的房水。使用CRISPR复合物的基因靶向在某些实施例中，CRISPR复合物用于修饰基因的DNA的特定的核苷酸序列。基因DNA的特定的核苷酸序列是“靶序列”CRISPR复合物是编码Cas蛋白的gRNA和内核苷酸的组合(gRNA：Cas内核苷酸)，或gRNA和Cas蛋白的组合(gRNA：Cas蛋白)。gRNA包括定向于靶向DNA序列的RNA序列。gRNA含有CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(trRNA或tracrRNA)。crRNA和trRNA可以与单个RNA分子，称为单引导RNA(sgRNA)相关联。或者，crRNA和trRNA可以在单独的RNA分子上分离，并形成双引导RNA(dgRNA)。gRNA可以靶向DNA的正链或负链。gRNA将Cas组分(即编码Cas蛋白的内核苷酸或Cas蛋白)导向至靶序列。gRNA与靶序列或靶序列的反向互补序列互补，并与之杂交。在一些实施例中，gRNA序列与靶序列100％互补或同一性。优选地，gRNA的向导序列与其对应的靶序列之间的互补或同一性程度至少约为50％或更高。例如，互补或同一性的程度可以是约50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，gRNA被化学修饰，并且包含一种或多种修饰的核苷或核苷酸。核苷和核苷酸的修饰可以包含以下一种或多种：i)磷酸二酯主链中的非连接磷酸氧基中的一个或两个和/或连接磷酸氧基中的一个或多个的改变，例如替换(例如，硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯键)；ii)核糖糖成分的改变，例如替换，如例如2’-O-甲基和/或2’-氟和/或4-硫代修饰；iii)用“去磷”连接子完全替换磷酸部分；iv)天然存在的核碱基的修饰或替换，包含用非经典的核碱基；v)磷酸核糖主链的替换或修饰；vi)寡核苷酸3’端或5’端的修饰，例如，末端磷酸基团的去除、修饰或替换，或部分、帽或连接子的缀合；vii)糖的修饰或替换；和viii)锁定或未锁定的核酸。其他修饰包含假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假尿苷5-甲基胞苷N-4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、N-4-甲基假尿苷、2-噻吩假尿苷、5-羟基假尿苷、5-氨基假尿苷、5-甲基假尿苷、N-6-甲基腺苷、7-脱氮腺苷、6-硫鸟苷、7-脱氮氮杂鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮氮杂鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷和6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷。在一些实施例中，Cas组分包括类型I组分、类型II组分或类型III组分。在某些实施例中，Cas组分是核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。优选地，Cas核酸酶是Cas9。在一些实施例中，基因编辑分子是Cas蛋白(例如，Cpf1、CasX、CasY、C2C2、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1orCsx12)、Cas10、Casl0d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cu1966或其同系物或修饰的版本)。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9蛋白(例如，野生型Cas9、Cas9切口酶、死Cas9(dCas9)或分裂Cas9)。在一些实施方案中，Cas9蛋白是化脓性链球菌Cas9蛋白或金黄色葡萄球菌Cas9蛋白。一旦引导至靶序列，Cas核酸酶切割靶序列。这会导致DNA中的双链断裂，或如果使用切口酶会导致单链断裂。DNA中的双链断裂可以经由非同源末端接合(NHEJ)修复，即断裂末端的重新连接。NHEJ可以产生插入缺失突变。可选地，可以经由同源修复或同源定向修复(HDR)来修复。在外源引入的修复模板存在的情况下，HR和HDR在靶位点处产生精确的、确定的修饰。在某些实施例中，修复模板含有编码靶基因上期望的突变的核苷酸序列，并且该核苷酸序列被插入基因的靶位点处。本文公开的一些序列包括以下列表(参见WO2017/185054)。SEQIDNO:1-93是TCF4基因的内含子3中的TNR的靶序列5'。SEQIDNO:94-190是TCF4基因的内含子3中的TNR的靶序列3'。SEQIDNO:191-1063是野生型COL8A2基因的靶序列。SEQIDNO:1064-1069是COL8A2Gln455Lys突变的靶序列。SEQIDNO:1070-1075是COL8A2Gln455al突变的靶序列。SEQIDNO:1076-1084是COL8A2Leu450Trp突变的靶序列。表A显示SEQIDNO:1085-1088的序列(参见来自WO2017/185054的示例性序列)。引导RNA和Cas组分(即CRISPR复合物)被包装到AAV载体中以递送到受试者。在某些实施例中，AAV载体可以自己递送。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。在一些实施例中，AAV载体可以直接递送到眼睛。可以将AAV载体施用至眼睛的前房、眼睛的后房、角膜或眼睛的玻璃状房。在某些实施例中，可以将AAV载体施用于角膜基质、角膜缘、角膜上皮表面上或角膜内皮膜上。在优选的实施例中，AAV载体直接施用于与角膜内皮直接接触的前房的房水。TCF4基因靶向TCF4基因位于18号染色体上。细胞发生位置为18q21.2(21.2位置处的18号染色体长臂)。分子位置在18号染色体上的碱基对55,222,311至55,635,993上(智人注释版本109，109,GRCh38.p12(NCBI))。靶序列可以在TCF4基因的TNR内或侧翼。Cas核酸酶被引导至靶序列。在一些实施例中，Cas核酸酶可以被引导至TCF4基因的TNR内的靶序列。在其他实施例中，Cas核酸酶可以被引导至TNR侧翼的靶序列。例如，Cas核酸酶可以定向至TNR的靶序列5’。或Cas核酸酶可以定向至TNR的靶序列3’。在一些实施例中，Cas蛋白可以被两个或更多个gRNA定向至TNR侧翼的两个靶序列。在一些实施例中，Cas核酸酶可以被两个或更多个gRNA定向至两个靶序列，其中一个在TCF4基因的TNR内，并且另一个在TCF4基因的TNR两侧。TCF4基因的靶序列选自SEQIDNO:1-190。SEQIDNO:1-93是TCF4基因的内含子3中的TNR的靶序列5'。SEQIDNO:94-190是TCF4基因的内含子3中的TNR的靶序列3'。TCF4基因的引导序列选自SEQIDNO:1089-1278。(参见序列表)所述一个或多个gRNA包括引导序列，其与在TCF4基因中的靶序列，或在TCF4基因中的靶序列的反向互补的互补性。在一些实施例中，gRNA序列与靶序列100％互补或同一性。优选地，gRNA的向导序列与其对应的靶序列之间的互补或同一性程度至少约为50％或更高。例如，互补或同一性的程度可以是约50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，使用一种gRNA。在其他实施例中，使用两种或更多种gRNA的组合。在某些实施例中，靶向TNR的序列5'的gRNA与靶向TNR的3'序列的gRNA组合使用，以切除TCF4基因的TNR。在一些实施例中，与选自SEQIDNO:1-93的靶序列互补的gRNA与与选自SEQIDNO:94-190的靶序列互补的gRNA一起使用。表1显示了靶序列和相应的引导序列(来自WO2017/185054的实施例1)。表2显示了引导序列的组合(来自WO2017/185054的实施例1)。(参见WO2017/185054的示例性序列)在其中CRISPR复合物包括编码蛋白质的内核苷酸的实施例中，内核苷酸可以与一个或多个转录或翻译控制序列可操作地连接。在某些实施例中，内核苷酸与一种或多种启动子可操作地连接。启动子可以是组成型的、诱导型的或组织特异性的。组成型启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒晚期(MLP)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段或其组合。诱导型启动子的实例包括但不限于由热休克、光、化学品、肽、金属、类固醇、抗生素或酒精诱导的那些。在一些实施例中，启动子可以是组织特异性的，例如对于在角膜例如角膜上皮中表达具有特异性的启动子。在一些实施例中，编码gRNA的核苷酸序列可以与至少一种转录或翻译控制序列可操作地连接。这些包括启动子、3'UTR或5'UTR。启动子可以被RNA聚合酶III(PolIII)识别，如但不限于U6PolIII启动子和H1PolIII启动子。PolIII启动子可以是例如小鼠或人的。在某些实施例中，一种或多种gRNA与编码Cas蛋白或Cas蛋白(例如Cas9)(即CRISPR复合物)的内核苷酸序列组合包装在AAV载体中。使用的AAV血清型没有特别限制。优选地，AAV载体是AAV5、AAV6或AAV8血清型。AAV-CRISPR复合物可以通过前房内或基质内注射直接输送到眼睛中。在某些实施例中，AAV载体可以自己递送。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。在一些实施例中，AAV载体可以直接递送到眼睛。AAV载体可以施用于眼前房、眼后房、角膜或眼玻璃体腔。在某些实施例中，可以将AAV载体施用于角膜基质、角膜缘、角膜上皮表面上或角膜内皮膜上。在优选的实施例中，AAV载体直接施用于与角膜内皮直接接触的前房的房水。COL8A2基因靶向COL8A2基因中的突变以及基因产物中的突变也可以用本文所述的方法和组合物进行治疗。这可以通过开发针对COL8A2基因中导致突变的特定序列的CRISPR复合物来实现。在一些实施例中，CRISPR复合物可用于切除COL8A2基因上的靶突变核苷酸序列，并切除编码突变基因产物的DNA的核苷酸序列。然后可以通过NHEJ过程修复DNA，导致插入缺失的产生和突变等位基因的丢失。在其他实施例中，CRISPR复合物的使用可以与HR/HDR的外源模板一起使用，或使用内源正常等位基因作为HR/HDR的模板，从而纠正导致COL8α2亚基中的氨基酸突变的核酸突变。可以纠正的突变包括：由c.1364C>A核苷酸变化引起的Gln455Lys突变；c.1363-1364CA>GT核苷酸变化引起的Gln455Val突变；或由c.1349T>G核苷酸变化引起的Leu450Trp突变。可以使用COL8A2基因的转录变体1的NCBI参考序列NM_005202.3来选择COL8A2基因的靶序列。该序列在COL8基因产物的氨基酸序列第455和450位不含有突变，可视为“野生型”COL8A2基因序列。可以在Chr1:36097532-36100270(hg38)之间选择靶序列。COL8A2基因的靶序列选自SEQIDNO:191-1063。野生型COL8A2基因的靶序列见表3。可以开发与这些靶序列互补的引导序列以靶向COL8A2基因。基于突变等位基因的核苷酸序列的差异，也可以开发突变等位基因的靶序列。表4显示了由c.1364C>A核苷酸变化引起的Gln155Lys突变的特异性靶序列(SEQIDNO:1064-1069)。表5显示了由c.1363-1364CA>GT核苷酸变化引起的Gln455Val突变的特异性靶序列(SEQIDNO:1070-1075)。表6显示了由c.1349T>G核苷酸变化引起的Leu450Trp突变的特异性靶序列(SEQIDNO:1076-1084)。可以使用包含与靶序列互补的引导序列或包含与靶序列的反向互补互补的引导序列的gRNA靶向突变等位基因。在某些实施例中，一种或多种gRNA与编码Cas蛋白或Cas蛋白(例如Cas9)(即CRISPR复合物)的内核苷酸序列组合包装在AAV载体中。使用的AAV血清型没有特别限制。优选地，AAV载体是AAV5、AAV6或AAV8血清型。AAV-CRISPR复合物可以通过前房内或基质内注射直接输送到眼睛中。在某些实施例中，AAV载体可以自己递送。在其他实施例中，AAV载体可以封装在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中以用于递送。在一些实施例中，AAV载体可以直接递送到眼睛。AAV载体可以施用于眼睛的前房、眼睛的后房或角膜。在某些实施例中，可以将AAV载体施用于角膜基质、角膜缘、角膜上皮表面上或角膜内皮膜上。在优选的实施例中，AAV载体直接施用于与角膜内皮直接接触的前房的房水。示例性实施例在特定实施例中，突变等位基因由靶基因上的靶序列编码。在一些实施例中，与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的至少一个核苷酸序列与受试者内的细胞中的靶基因上的靶序列杂交。在某些实施例中，靶基因是TCF4或COL8A2。在一些实施例中，至少一个靶序列选自SEQIDNO:1-1084。在一些实施例中，至少一个靶序列对TCF4基因具有特异性，并且靶序列选自SEQIDNO:1-190。在一些实施例中，靶序列对COL8A2基因具有特异性，并且靶序列选自SEQIDNO:191-1084。在一些实施例中，核酸编辑系统是CRISPR系统、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或安塔够妙RNA(antagomirRNA)。在一些实施例中，核酸编辑系统是CRISPR系统。在一些实施例中，核酸编辑系统是CRISPR-Cas系统。在一些实施例中，CRISPR-Cas系统包含编码CRISPR相关(Cas)基因的核苷酸序列和编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列。在一些实施例中，Cas基因编码Cas蛋白质。在一些实施例中，由Cas基因编码的Cas蛋白是Cas核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是Cas9。在一些实施例中，引导RNA包含CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA或trRNA)。在一些实施例中，引导RNA是单一引导RNA(sgRNA)，并且crRNA和tracrRNA结合在一个引导RNA分子上。在一些实施例中，引导RNA是双引导RNA(dgRNA)，并且crRNA和tracrRNA在分开的RNA分子上，同时使用但不组合。在一些实施例中，CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas9系统。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA与编码Cas9核酸酶的核苷酸序列形成复合物。在一些实施例中，与至少一个突变等位基因互补的核苷酸序列是gRNA。在一些实施例中，至少一个引导RNA包含与选自SEQIDNO:1-1084的至少一个靶序列互补的crRNA序列。在一些实施例中，至少一个引导RNA包含选自SEQIDNO:1089-1278的引导序列。在一些实施例中，递送系统、载体、基因编辑系统或组合物进一步包含修复模板。在一些实施例中，修复模板选自DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。在一些实施例中，AAV载体血清型选自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10。在一些实施例中，AAV载体血清型是AAV5、AAV6或AAV8。在一些实施例中，AAV载体血清型是AAV5。在一些实施例中，AAV载体血清型是AAV6。在一些实施例中，AAV载体血清型是AAV8。在一些实施例中，递送系统、载体、核苷酸或基因编辑系统或组合物进一步包含启动子。在一些实施例中，启动子被优化以与AAV5、AAV6或AAV8载体一起使用。在一些实施例中，启动子是组织特异性的，并且当与AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作地连接时，在所述眼睛中具有活性。在一些实施例中，组织特异性启动子在角膜或其他前眼组织中具有活性。在一些实施例中，组织特异性启动子在角膜内皮中具有活性。在一些实施例中，靶基因优先在眼睛的前部表达。优选地，靶基因优先在角膜中表达，最优选地，优先在角膜内皮中表达。在一些实施例中，递送系统、载体、核苷酸或基因编辑系统或组合物在IC注射后优先在眼睛的前部表达。优选地，在IC注射后，递送系统、载体、核苷酸或基因编辑系统或组合物优先在角膜中表达，最优选地，优先在角膜内皮中表达。在一些实施例中，递送系统、载体、核苷酸或基因编辑系统或组合物适用于治疗眼部疾病或病症。在一些实施例中，眼睛中的疾病或病症是角膜的疾病或病症。在一些实施例中，角膜疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。在一些实施例中，角膜疾病或病症是后角膜营养不良。在一些实施例中，后角膜营养不良是富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早期和晚期发病)、后多形性营养不良(PPCD；1、2和3型)、先天性内皮营养不良(1和2型)和X相关的内皮角膜营养不良。在一些实施例中，角膜营养不良是FECD。实例实例1.制备和施用AAV载体的方法AAV载体野生型AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9载体通过本领域已知的方法产生。每个AAV在无处不在的CAG启动子下编码eGFP。每个AAV以1e13vg/mL的浓度提供在PBS 0.001％聚醚酸制剂中。前房内(IC)注射成年雄性C57BL/6J小鼠(10-11周龄)购自杰克森实验室(JacksonLaboratories)。所有动物程序和处理均根据ARVO动物使用声明和再生元制药(RegeneronPharmaceuticals)IACUC审查协议进行。通过腹膜内注射用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉小鼠。用无菌盐水冲洗眼睛，然后滴一滴托吡卡胺(以扩张瞳孔)和一滴丙对卡因(以麻痹角膜)。使用配备拉式玻璃针(砂纸斜面)的DrummondScientificNanojectII显微注射装置，将AAV溶液填充到针中并用于将AAV溶液注入每个前房。玻璃针穿过角膜，平行于虹膜，注入前房的房水。允许少量房水漏出。气泡被推入角膜，然后是1.5μL的AAV溶液，含有1.5e10vg。注射后，针头保持静止30秒，然后快速平稳地拔出。注射每只动物的OD(右眼)和OS(左眼)。对照动物接受了PBS 0.001％普鲁尼克酸的注射，而不是AAV溶液。将Genteal软膏涂抹在每只眼睛上以防止角膜干燥和磨损，同时将小鼠置于其腹侧(以防止渗漏和积聚)以从麻醉中恢复。玻璃体内注射成年雄性C57BL/6J小鼠(10-11周龄)购自杰克森实验室(JacksonLaboratories)。所有动物程序和处理均根据ARVO动物使用声明和再生元制药(RegeneronPharmaceuticals)IACUC审查协议进行。通过腹膜内注射用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉小鼠。用无菌盐水冲洗眼睛，然后滴一滴托吡卡胺(以扩张瞳孔)和一滴丙对卡因(以麻痹角膜)。使用配备拉式玻璃针(砂纸斜面)的DrummondScientificNanojectII显微注射装置，将AAV溶液填充到针中并用于将AAV溶液注射到玻璃体腔的玻璃体液中。玻璃针通过眼缘巩膜注入玻璃体腔。使用显微注射装置将含有1.5e10vg的1.5μLAAV溶液注入玻璃体腔。针被快速平稳地拔出。注射每只动物的OD(右眼)和OS(左眼)。对照动物接受了PBS 0.001％普鲁尼克酸的注射，而不是AAV溶液。将Genteal软膏涂抹在每只眼睛上以防止角膜干燥和磨损，同时将小鼠置于其腹侧(以防止渗漏和积聚)以从麻醉中恢复。实例2.评估蛋白质靶向眼中不同组织的特异性。体内成像在注射前的基线和注射后的时间点使用HeidelbergSpectralisHRA OCT(HeidelbergEngineering,Inc,Germany)进行体内成像。小鼠被麻醉，每只眼睛滴一滴托吡卡胺以扩张瞳孔，然后滴一滴丙胺卡因使角膜麻木。在每个时间点，对后部视网膜眼底( 25屈光度小动物成像镜头)和前角膜(前段模块)拍摄红外图像和荧光图像以检测AAV-eGFP荧光。HeidelbergSpectralisHRA OCT上的FA模式用于检测AAV-eGFP注射产生的eGFP蛋白的荧光。免疫组化通过眼内注射接受AAV-eGFP注射(如AAV5-eGFP、AAV6-eGFP和AAV8-eGFP)的小鼠被安乐死以摘除眼睛。对接受PBS 0.001％普鲁尼克酸眼内注射的对照小鼠实施安乐死以摘除眼睛。将每只眼睛摘除并固定在4℃温度条件下4％PFA中过夜。在PBS中清洗眼睛，然后在4℃下在30％蔗糖中孵育至少3天。然后将眼睛嵌入OCT包埋剂中，并将一部分样本送交HistoservInc(马里兰州)进行横截面切片。为了放大AAV-eGFP定位区域，将eGFP的一抗在含有横切小鼠眼组织的载玻片上于4℃下孵育过夜。二抗与Alexa-Fluor594(红色)结合，以区别于绿色内源性eGFP未放大信号。DAPI(蓝色)被添加到载玻片中以标记细胞核并帮助识别细胞类型和区域。使用Keyence显微镜(KeyenceCorporationofAmerica，Illinois，USA)对载玻片成像。评估了解剖眼部区域和细胞定位的绿色和/或红色荧光区域。eGFP蛋白测量通过眼内注射递送的每种AAV血清型(例如AAV5-eGFP、AAV6-eGFP、AAV8-eGFP)的四只小鼠(整只眼睛)被安乐死以摘除眼睛。两只接受PBS 0.001％普鲁尼克酸的小鼠被包括作为每个AAV血清型测试的对照，并被安乐死以摘除眼睛。每只眼睛都是分开的，并作为一个单独的样本进行处理。将眼睛浸入1X细胞提取缓冲液PTR(在ELISA试剂盒中提供)中，并使用带有不锈钢珠的组织裂解仪进行匀浆。离心样品并收集含有裂解物的蛋白质。使用BCA试剂盒(PierceBCA蛋白定量分析试剂盒，ThermoFisher)测量总蛋白测量值。使用GFPSimpleStepELISA试剂盒(Abcam)一式三份测定样品的eGFP蛋白表达。每只眼睛的eGFP表达计算为从眼睛中分离出的总蛋白质的ng/μg。转导效率和趋向性取决于所使用的AAV血清型。使用HeidelbergSpectralis体内成像，确定了IC给药后的AAV转导区域。AAV2、AAV6、AAV8和AAV9在使用AAV2进行IC给药后靶向眼的后区段和前区段，AAV6和AAV9在前区段显示出最强的eGFP表达，而AAV5仅针对前眼组织。数据还表明，AAV5、AAV6和AAV8在IC注射后对前部区域具有强烈的趋向性。此外，IC注射还能够将AAV递送到后部组织，如IC注射后AAV2和AAV9向后部区域的强烈趋向性所示。实例3.角膜内皮细胞基因突变的校正通过施用包含包含CRISPR/Cas复合物的核酸编辑系统的组合物，对角膜内皮细胞中的靶基因突变(例如TCF4或COL8A2中的突变)进行校正。CRISPR/Cas复合物包含与包含突变的靶基因的一部分互补并针对靶DNA序列的引导序列，以及编码Cas核酸酶的内核苷酸。CRISPR/Cas复合体被引导到靶序列，Cas核酸酶切割靶序列。通过切割靶序列并修复DNA中的断裂来纠正基因插入突变。作为核苷酸变化的基因突变通过切割突变的核苷酸序列并用包含野生型基因的核苷酸序列的修复模板修复DNA来校正。CRISPR/Cas复合物优选包装在AAV载体中，例如AAV5、AAV6或AAV8。AAV载体通过本领域已知的方法产生。每个AAV在无处不在的CAG启动子下编码一个靶序列。每个AAV在PBS 0.001％聚醚酸制剂中以1e13g/mL的浓度提供。与CRISPR/Cas复合物包装在一起的AAV载体通过前房内注射直接施用于眼前房。通过腹膜内注射用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉携带此类突变的小鼠。用无菌盐水冲洗眼睛，然后滴一滴托吡卡胺(以扩张瞳孔)和一滴丙对卡因(以麻痹角膜)。使用配有拉玻璃针(砂纸斜面)的DrummondScientificNanojectII显微注射装置，将AAV溶液填充到针中，并用于将AAV溶液注入每个前房。玻璃针穿过角膜，平行于虹膜，注入前房的房水。允许少量房水漏出。气泡被推入角膜，然后是1.5μL的AAV溶液，含有1.5e10vg。注射后针头保持静止30秒，然后快速平稳地拔出。注射每只动物的OD(右眼)和OS(左眼)。对照动物接受PBS 0.001％聚醚酸而不是AAV溶液的注射。将Genteal软膏涂在每只眼睛上，以防止角膜干燥和磨损，同时将小鼠放在腹侧(以防止泄漏和积聚)以从麻醉中恢复。通过从治疗和对照小鼠的眼睛解剖角膜(以及从所述角膜中分离内皮细胞)并进行DNA和/或RNA核酸测序来确认基因表达的校正。实例4-角膜内皮细胞中基因表达的下调。通过施用包含与靶基因上的至少一个等位基因互补的至少一种抑制性核苷酸序列的组合物下调基因表达，所述靶基因选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或antagomirRNA。靶基因是任何角膜突变基因，例如TCF4或COL8A2。抑制性RNA单独存在于组合物中，或作为CRISPR/Cas复合物的一部分存在。类似于实施例3，抑制性RNA被包装在AAV载体中。抑制性RNA优选包装在AAV载体中，例如AAV5、AAV6或AAV8。AAV载体通过本领域已知的方法产生。每个AAV在无处不在的CAG启动子下编码一个靶序列。每个AAV在PBS 0.001％聚醚酸制剂中以1e13g/mL的浓度提供。与实施例3类似，通过前房内注射将包装有抑制性RNA的AAV载体直接施用于眼睛的前房。通过腹膜内注射用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉小鼠。用无菌盐水冲洗眼睛，然后滴一滴托吡卡胺(以扩张瞳孔)和一滴丙对卡因(以麻痹角膜)。使用配有拉玻璃针(砂纸斜面)的DrummondScientificNanojectII显微注射装置，将AAV溶液填充到针中，并用于将AAV溶液注入每个前房。玻璃针穿过角膜，平行于虹膜，注入前房的房水。允许少量房水漏出。气泡被推入角膜，然后是1.5μL的AAV溶液，含有1.5e10vg。注射后针头保持静止30秒，然后快速平稳地拔出。注射每只动物的OD(右眼)和OS(左眼)。对照动物接受PBS 0.001％聚醚酸而不是AAV溶液的注射。将Genteal软膏涂在每只眼睛上，以防止角膜干燥和磨损，同时将小鼠放在腹侧(以防止泄漏和积聚)以从麻醉中恢复。通过解剖治疗小鼠和对照小鼠的眼睛的角膜，并通过蛋白质印迹测量样品中基因编码的蛋白质的量，证实了基因表达的下调。基因表达的成功下调导致治疗小鼠与对照小鼠角膜组织中编码蛋白的水平降低。已经详细描述了本发明，包括其优选实施例。然而，应当理解，本领域技术人员在考虑到本公开内容后，可以对本发明进行修改和/或改进，这些修改和/或改进属本发明的范围和精神之内。WO2017/185054示例性序列表A。SEQIDNO.:1085-1088##表1。TCF4靶序列和相应的引导序列表2。TCF4引导序列组合表3。野生型COL8A2基因的靶序列表4。存在Gln455Lys突变的COL8A2靶序列表5。存在Gln455Val突变的COL8A2靶序列表6。存在Leu450Trp突变的COL8A2靶序列SEQIDNo靶定位靶链靶序列1076Chr1:36098311-36098333-TGGGGGCTCCCTGGGCAGCCTGG1077Chr1:36098319-36098341-AAGGTGACTGGGGGCTCCCTGGG1078Chr1:36098320-36098342-AAAGGTGACTGGGGGCTCCCTGG1079Chr1:36098328-36098350-TGGGGCAGAAAGGTGACTGGGGG1080Chr1:36098329-36098351-CTGGGGCAGAAAGGTGACTGGGG1081Chr1:36098330-36098352 CCCAGTCACCTTTCTGCCCCAGG1082Chr1:36098330-36098352-CCTGGGGCAGAAAGGTGACTGGG1083Chr1:36098331-36098353 CCAGTCACCTTTCTGCCCCAGGG1084Chr1:36098331-36098353-CCCTGGGGCAGAAAGGTGACTGG序列表<110>瑞泽恩制药公司(RegeneronPharmaceuticalsInc.)<120>用于递送治疗剂的腺相关病毒载体<130>67000-1023WO<160>1278<210>SEQIDNO1<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列1ttggcaagtggacattttactgg23<210>SEQIDNO2<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:2tgtccacttgccaaagaagttgg23<210>SEQIDNO3<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:3ggaccaacttctttggcaagtgg23<210>SEQIDNO4<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:4gaaaaatggaccaacttctttgg23<210>SEQIDNO5<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:5ccatttttcccactgctcacagg23<210>SEQIDNO6<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:6cctgtgagcagtgggaaaaatgg23<210>SEQIDNO7<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:7tttttcccactgctcacaggagg23<210>SEQIDNO8<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:8tttcacctcctgtgagcagtggg23<210>SEQIDNO9<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:9ttttcacctcctgtgagcagtgg23<210>SEQIDNO10<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:10agatctttgaggagctctgaagg23<210>SEQIDNO11<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:11aacagtatgaaagatctttgagg23<210>SEQIDNO12<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:12agcataaactctaagctgtttgg23<210>SEQIDNO13<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:13acagcttagagtttatgctaagg23<210>SEQIDNO14<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:14cagcttagagtttatgctaaggg23<210>SEQIDNO15<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:15tcttttagttttaagttggatgg23<210>SEQIDNO16<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:16tttctcttttagttttaagttgg23<210>SEQIDNO17<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:17gtgataatgggggctggggtggg23<210>SEQIDNO18<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:18agtgataatgggggctggggtgg23<210>SEQIDNO19<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:19cagagtgataatgggggctgggg23<210>SEQIDNO20<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:20acagagtgataatgggggctggg23<210>SEQIDNO21<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:21aacagagtgataatgggggctgg23<210>SEQIDNO22<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:22aaagaacagagtgataatggggg23<210>SEQIDNO23<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:23gaaagaacagagtgataatgggg23<210>SEQIDNO24<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:24agaaagaacagagtgataatggg23<210>SEQIDNO25<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:25aagaaagaacagagtgataatgg23<210>SEQIDNO26<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:26tctgttctttctttttcctcagg23<210>SEQIDNO27<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:27ttttcctcaggttcattagatgg23<210>SEQIDNO28<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:28ttggccatctaatgaacctgagg23<210>SEQIDNO29<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:29aatgtagcagtagtactgcttgg23<210>SEQIDNO30<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:30agcagtactactgctacatttgg23<210>SEQIDNO31<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:31tgaatcttgataacattatgggg23<210>SEQIDNO32<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:32ctgaatcttgataacattatggg23<210>SEQIDNO33<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:33ccataatgttatcaagattcagg23<210>SEQIDNO34<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:34cctgaatcttgataacattatgg23<210>SEQIDNO35<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:35aatgttatcaagattcaggttgg23<210>SEQIDNO36<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:36gttatcaagattcaggttggagg23<210>SEQIDNO37<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:37tgtttttctagagaggctgctgg23<210>SEQIDNO38<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:38aaactagtgtttttctagagagg23<210>SEQIDNO39<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:39gaaaaacactagtttcaccaagg23<210>SEQIDNO40<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:40aacaacttttttcttctccttgg23<210>SEQIDNO41<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:41ttgttttatattgaaaaccttgg23<210>SEQIDNO42<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合成：靶序列（包括PAM）<400>序列:42gaaaaccttggccataaacgtgg23<210>SEQIDNO43<211>长度:23<212>类型：DNA<213>有机体：人工序列<220>特征:<223>其它信息：合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