技术特征：
1.一种组合物，包含：
a)AAV载体的核苷酸序列或其中一部分；和
b)核酸编辑系统，所述核酸编辑系统包含：至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列与角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因互补；核酸，所述核酸能够下调与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因的基因表达；和/或至少一个核苷酸序列或其中一部分，所述至少一个核苷酸序列或其中一部分编码在眼睛中待表达的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中与其他眼部组织或细胞相比，优先在所述眼睛的前部中表达所述蛋白质。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中与其他眼部组织或细胞相比，优先在所述角膜中表达所述蛋白质。
4.根据权利要求4所述的组合物，其中所述蛋白质是转录因子、胶原蛋白、核酸酶或荧光蛋白。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述蛋白质是转录因子4(TCF4)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸编辑系统是CRISPR系统。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸编辑系统是CRISPR-Cas系统。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CRISPR-Cas系统包含编码CRISPR相关(Cas)基因的核苷酸序列和编码引导RNA(gRNA)的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas9系统。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中与至少一个突变等位基因互补的核苷酸序列是gRNA。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的至少一个核苷酸序列选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或安塔够妙RNA。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述突变等位基因由所述靶基因上的靶序列编码。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的至少一个核苷酸序列与受试者中的细胞中的所述靶基因上的靶序列杂交。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶基因是TCF4或COL8A2。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-1084。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个靶序列对TCF4基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:1-190。
17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶序列对COL8A2基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:191-1084。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个引导RNA包含与选自SEQ ID NO:1-1084的至少一个靶序列互补的crRNA序列。
19.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个引导RNA包含选自SEQ ID NO:1089-1278的引导序列。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编辑系统进一步包含修复模板。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述修复模板选自：DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。
22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述AAV载体血清型选自AAV5、AAV6和AAV8。
23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述AAV载体血清型是AAV5。
24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述AAV载体血清型是AAV6。
25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述AAV载体血清型是AAV8。
26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含启动子。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述启动子被优化以与AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体一起使用。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述启动子是组织特异性的，并且当与所述AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作地连接时，在所述眼睛中具有活性。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组织特异性启动子在所述角膜中具有活性。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组织特异性启动子在所述角膜的内皮中具有活性。
31.根据权利要求1所述的组合物，其中在前房内(IC)注射后优先在所述眼睛的前部中表达所述靶基因。
32.根据权利要求1所述的组合物，其中所述角膜的疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。
33.根据权利要求1所述的组合物，其中所述角膜的疾病或病症是后角膜营养不良。
34.根据权利要求32所述的组合物，其中所述后角膜营养不良选自：富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早发型和晚发型)、后多形性营养不良(PPCD；1型、2型和3型)、先天性内皮营养不良(1型和2型)和X连锁性内皮角膜营养不良。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述角膜营养不良是FECD。
36.根据权利要求1所述的组合物，其中与其他眼部组织或细胞相比，优先在所述眼睛的后部中表达所述蛋白质。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述AAV载体血清型选自AAV2和AAV9。
38.一种在有此需要的受试者的眼睛中表达蛋白质的方法，所述方法包含：
a)提供一种或多种包含编码所述蛋白质的核苷酸序列的腺相关(AAV)载体；和
b)将所述AAV载体给药于所述眼睛。
39.根据权利要求38所述的方法，其中与所述眼睛的其他部位相比，优先在所述眼睛的前部中表达所述蛋白质。
40.根据权利要求39所述的方法，其中与所述眼睛中的其他组织或细胞相比，优先在角膜中表达所述蛋白质。
41.根据权利要求40所述的方法，其中与眼睛中的其他组织或细胞相比，优先在所述角膜的内皮细胞中表达所述蛋白质。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述AAV载体血清型选自AAV5、AAV6和AAV8。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV5。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV6。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV8。
46.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质是Cas蛋白质。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述蛋白质是Cas9。
48.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子、胶原蛋白、核酸酶或荧光蛋白。
49.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质是转录因子4(TCF4)。
50.根据权利要求38所述的方法，其中所述载体进一步包含修复模板。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述修复模板选自：DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述载体进一步包含启动子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述启动子被优化以与AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体一起使用。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述启动子是组织特异性的，并且当与所述AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作地连接时，在所述眼睛中具有活性。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述组织特异性启动子在角膜中具有活性。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述组织特异性启动子在角膜的内皮中具有活性。
57.根据权利要求38所述的方法，其中经由注射到所述眼睛中将所述载体给药于所述受试者。
58.根据权利要求57所述的方法，其中经由注射到所述眼睛的前部将所述载体给药于所述受试者。
59.根据权利要求57所述的方法，其中将所述载体给药于角膜基质、角膜缘、给药于角膜的上皮表面或角膜的内皮膜上。
60.根据权利要求57所述的方法，其中经由前房内(IC)注射将所述载体给药于所述受试者。
61.根据权利要求38所述的方法，其中与其他眼部组织或细胞相比，在IC注射后优先在角膜中表达所述蛋白质。
62.根据权利要求38所述的方法，其中与其他眼部组织或细胞相比，在IC注射后优先在角膜内皮细胞中表达所述蛋白质。
63.根据权利要求38所述的方法，所述方法适用于治疗所述眼睛中的疾病或病症。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述眼睛中的疾病或病症是角膜的疾病或病症。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是后角膜营养不良。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述后角膜营养不良是富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早发型和晚发型)、后多形性营养不良(PPCD；1型、2型和3型)、先天性内皮营养不良(1型和2型)和X连锁性内皮角膜营养不良。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述角膜营养不良是FECD。
69.根据权利要求38所述的方法，其中与所述眼睛的其他部位相比，优先在所述眼睛的后部中表达所述蛋白质。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述AAV载体血清型选自AAV2和AAV9。
71.一种用于修复在有此需要的受试者中的角膜中表达的基因的方法，所述方法包含：
a)提供一种包含核酸编辑系统的递送系统，所述核酸编辑系统包含至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因互补；以及
b)将所述递送系统给药于所述受试者的角膜。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述核酸编辑系统是CRISPR-Cas系统。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas9系统。
74.根据权利要求71所述的方法，其中与至少一个突变等位基因互补的所述核苷酸序列是gRNA。
75.根据权利要求71所述的方法，其中与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的所述至少一个核苷酸序列选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或安塔够妙RNA。
76.根据权利要求71所述的方法，其中所述突变等位基因由所述靶基因上的靶序列编码。
77.根据权利要求71所述的方法，其中与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的所述至少一个核苷酸序列与所述受试者中的细胞中的所述靶基因上的靶序列杂交。
78.根据权利要求71所述的方法，其中所述靶基因是TCF4或COL8A2。
79.根据权利要求71所述的方法，其中至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-1084。
80.根据权利要求71所述的方法，其中至少一个靶序列对所述TCF4基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:1-190。
81.根据权利要求71所述的方法，所述靶序列对COL8A2基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:191-1084。
82.根据权利要求71所述的方法，其中所述递送系统进一步包含修复模板。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述修复模板选自：DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。
84.根据权利要求74所述的方法，其中所述gRNA与所述受试者中的细胞中的所述靶基因的靶序列杂交。
85.根据权利要求71所述的方法，其中所述递送系统进一步包含启动子。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述启动子被优化以与AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体一起使用。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述启动子是组织特异性的，并且当与所述AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作连接时，在所述眼睛中具有活性。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述组织特异性启动子在所述角膜中具有活性。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述组织特异性启动子在所述角膜的内皮中具有活性。
90.根据权利要求71所述的方法，其中所述递送系统经由注射到所述眼睛中给药于所述受试者。
91.根据权利要求71所述的方法，其中经由注射到所述眼睛的前部将所述递送系统给药于所述受试者。
92.根据权利要求71所述的方法，其中将所述递送系统给药于角膜基质、角膜缘、给药于角膜的上皮表面或角膜的内皮膜上。
93.根据权利要求71所述的方法，其中经由前房内注射将所述递送系统给药于所述受试者。
94.根据权利要求71所述的方法，所述方法适用于治疗所述眼睛中的疾病或病症。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述眼睛中的疾病或病症是所述角膜的疾病或病症。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是后角膜营养不良。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述后角膜营养不良选自：富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早发型和晚发型)、后多形性营养不良(PPCD；1型、2型和3型)、先天性内皮营养不良(1型和2型)和X连锁性内皮角膜营养不良。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述角膜营养不良是FECD。
100.一种治疗有此需要的受试者中的由包含三核苷酸重复序列(TNR)和/或点突变的基因的突变等位基因引起的角膜的疾病或病症的方法，所述方法包含：
a)切除所述基因内的所述三核苷酸重复序列(TNR)的至少一部分，包含：
i)提供包含编码一个或多个CRISPR引导RNA的一个或多个核苷酸序列的AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，所述一个或多个CRISPR引导RNA靶向所述TNR内的序列、所述TNR的5'、所述TNR的3'或它们的组合；以及
ii)将所述载体给药于所述角膜；和/或
b)校正所述基因或基因产物的所述点突变，包含：
i)提供包含编码一个或多个CRISPR引导RNA的一个或多个核苷酸序列的AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体，所述一个或多个CRISPR引导RNA靶向与基因产物中的点突变相关的所述基因中的序列；以及
ii)将所述载体给药于所述角膜；
其中优先在所述角膜中表达所述一个或多个核苷酸序列。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶基因是TCF4或COL8A2。
102.根据权利要求100所述的方法，其中至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-1084。
103.根据权利要求100所述的方法，其中至少一个靶序列对TCF4基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:1-190。
104.根据权利要求100所述的方法，其中所述靶序列对COL8A2基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:191-1084。
105.根据权利要求100所述的方法，其中使用两个引导RNA。
106.根据权利要求100所述的方法，其中至少一个引导RNA包含与选自SEQ ID NO:1-1084的至少一个靶序列互补的crRNA序列。
107.根据权利要求100所述的方法，其中至少一个引导RNA包含选自SEQ ID NO:1089-1278的引导序列。
108.根据权利要求100所述的方法，其中所述TNR位于TCF4基因的内含子3中。
109.根据权利要求100所述的方法，其中至少一个引导RNA包含与所述TCF4基因的至少一个靶序列互补的引导序列，并且其中所述靶序列选自SEQ ID NO:1-190。
110.根据权利要求109所述的方法，其中使用两个引导RNA，并且其中一个引导RNA与所述TNR的靶序列5'互补，并且另一个引导RNA与所述TNR的靶序列3'互补。
111.根据权利要求100所述的方法，其中所述点突变位于COL8A2基因中，并且其中所述靶序列选自SEQ ID NO:1064-1084。
112.根据权利要求100所述的方法，其中所述AAV载体包含Cas蛋白。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9核酸酶。
114.根据权利要求100所述的方法，其中所述TNR位于所述TCF4基因的内含子3中。
115.根据权利要求113所述的方法，其中所述Cas9核酸酶裂解所述TNR。
116.根据权利要求100所述的方法，其中使用两种gRNA，每一者都包含引导序列，并且其中一个引导序列将核酸酶指引到TCF4基因的内含子3上的第一位置，并且另一引导序列将核酸酶指引到TCF4基因的内含子3上的第二位置。
117.根据权利要求113所述的方法，其中所述核酸酶裂解TCF4的内含子3，并且切除第一裂解位置与第二裂解位置之间的核酸片段。
118.根据权利要求117所述的方法，其中切除的核酸片段含有一个或多个TNR。
119.根据权利要求100所述的方法，所述方法适用于治疗与所述TNR相关的疾病或病症。
120.根据权利要求100所述的方法，所述方法适用于治疗与TCF4基因的内含子3中的TNR相关的疾病或病症。
121.根据权利要求100所述的方法，所述方法适用于治疗与COL8A2基因上的点突变相关的疾病或病症。
122.根据权利要求100所述的方法，其中所述载体进一步包含修复模板。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述修复模板选自DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。
124.根据权利要求100所述的方法，其中所述载体进一步包含启动子。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述启动子被优化以与AAV5载体、AAV6载体或AAV8载体一起使用。
126.根据权利要求124所述的方法，其中所述启动子是组织特异性的，并且当与所述AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作地连接时，在所述眼睛中具有活性。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述组织特异性启动子在所述角膜中具有活性。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述组织特异性启动子在所述角膜的内皮中具有活性。
129.根据权利要求100所述的方法，其中经由注射到所述眼睛中将所述载体给药于所述受试者。
130.根据权利要求100所述的方法，其中经由注射到所述眼睛的前部将所述载体给药于所述受试者。
131.根据权利要求100所述的方法，其中将载体系统给药于角膜基质、角膜缘、给药于角膜的上皮表面或角膜的内皮膜上。
132.根据权利要求100所述的方法，其中经由前房内(IC)注射将载体系统给药于所述受试者。
133.根据权利要求100所述的方法，其中与所述眼睛中的其他细胞相比，在IC注射后优先在所述角膜内皮细胞中表达所述一个或多个核苷酸序列。
134.根据权利要求100所述的方法，所述方法适用于治疗所述眼睛中的疾病或病症。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述眼睛中的疾病或病症是所述角膜的疾病或病症。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是后角膜营养不良。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述后角膜营养不良选自：富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早发型和晚发型)、后多形性营养不良(PPCD；1型、2型和3型)、先天性内皮营养不良(1型和2型)和X连锁性内皮角膜营养不良。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述角膜营养不良是FECD。
140.一种下调在有此需要的受试者中的角膜中表达的基因的表达的方法，所述方法包含将递送系统给药于所述受试者，所述包含：
a)AAV载体的核苷酸序列或其中一部分；
b)能够下调与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因的基因表达的核酸；和
c)将所述递送系统给药于所述角膜。
141.根据权利要求140所述的方法，其中能够下调基因表达的所述核酸是CRISPR系统核酸序列。
142.根据权利要求140所述的方法，其中能够下调基因表达的所述核酸是CRISPR-Cas系统。
143.根据权利要求140所述的方法，其中所述CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas9系统。
144.根据权利要求140所述的方法，其中能够下调基因表达的所述核酸选自反义RNA、安塔够妙RNA、siRNA、shRNA。
145.根据权利要求140所述的方法，进一步包含至少一个核苷酸序列，所述至少一个核苷酸序列与所述角膜中的疾病或病症相关的靶基因上的至少一个突变等位基因互补。
146.根据权利要求140所述的方法，其中所述靶基因是TCF4或COL8A2。
147.根据权利要求146所述的方法，其中至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-1084。
148.根据权利要求146所述的方法，其中至少一个靶序列对所述TCF4基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:1-190。
149.根据权利要求146所述的方法，其中所述靶序列对COL8A2基因具有特异性，并且所述靶序列选自SEQ ID NO:191-1084。
150.根据权利要求140所述的方法，其中所述AAV载体血清型选自AAV5、AAV6和AAV8。
151.根据权利要求140所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV5。
152.根据权利要求140所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV6。
153.根据权利要求140所述的方法，其中所述AAV载体血清型是AAV8。
154.根据权利要求140所述的方法，其中所述递送系统进一步包含修复模板。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述修复模板选自：DNA修复模板、mRNA修复模板、siRNA修复模板、miRNA修复模板和反义寡核苷酸修复模板。
156.根据权利要求140所述的方法，其中所述递送系统进一步包含启动子。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述启动子被优化以与AAV5、AAV6或AAV8载体一起使用。
158.根据权利要求156所述的方法，其中所述启动子是组织特异性的，并且当与所述AAV载体或作为与靶基因上的至少一个突变等位基因互补的序列的核苷酸可操作地连接时，在所述眼睛中具有活性。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述组织特异性启动子在所述角膜中具有活性。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述组织特异性启动子在角膜内皮中具有活性。
161.根据权利要求140所述的方法，其中优先在所述眼睛的前部中表达所述靶基因。
162.根据权利要求140所述的方法，其中在IC注射后优先在所述前部中表达能够下调至少一个靶基因上的至少一个突变等位基因的所述递送系统和/或所述核苷酸序列。
163.根据权利要求140所述的方法，所述方法适用于治疗所述眼睛中的疾病或病症。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述眼睛中的疾病或病症是所述角膜的疾病或病症。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是浅表角膜营养不良、前角膜营养不良、角膜基质营养不良或后角膜营养不良。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述角膜的疾病或病症是后角膜营养不良。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述后角膜营养不良选自：富克斯内皮角膜营养不良(FECD；早发型和晚发型)、后多形性营养不良(PPCD；1型、2型和3型)、先天性内皮营养不良(1型和2型)和X连锁性内皮角膜营养不良。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述角膜营养不良是FECD。
技术总结
本文提供使用AAV载体将治疗剂选择性地递送到眼睛的方法。例如，可以使用所描述的方法特异性地靶向角膜。本文还提供包含用CRISPR复合物包装的AAV载体的组合物，所述组合物可被直接递送到所述眼睛，例如所述角膜，并且具体地角膜内皮。可以使用本文所述的方法和组合物治疗包含所述眼睛中的组织诸如所述角膜内皮的异常或退化的疾病和病症(例如FECD)。
技术研发人员：安·J·利戈基;卡梅罗·罗曼诺;
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司;
技术研发日：2020.02.27
技术公布日：2021.10.26
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
