一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法与流程

1.本发明涉及宠物食品检测领域，特别是涉及一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法。


背景技术：

2.宠物食品是专门为宠物、小动物提供的食品，介于人类食品与传统畜禽饲料之间的高档动物食品。其作用主要是为各种宠物提供最基础的生命保证、生长发育和健康所需的营养物质，具有营养全面、消化吸收率高、配方科学、质量标准、饲喂使用方便以及可预防某些疾病等优点。
3.美国的宠物食品市场一直代表全球宠物食品的发展趋势，在每年举办的奥兰多宠物展上，各大宠物食品品牌都会竞相发布新品。在刚刚过去的2020年奥兰多宠物展出现的众多新品中，最引人注意的应该是发布了越来越添加大麻二酚的宠物食品。
4.大麻二酚是药用植物大麻中的主要化学成分，提取自雌性大麻植株，是大麻中的非成瘾性成分，具有抗痉挛、抗焦虑、抗炎等药理作用。它作为添加剂在宠物用品中使用，主粮、零食、甚至洗浴香波里都可以添加，能起到防止跳蚤和镇定性功能，可以帮助宠物在紧张的时候放松下来，与人类更加友好的互动，受到很多爱宠人士的关注。
5.但是现如今，这类产品还不可以通过进口方式进入中国。原因在于，依据现行法律法规，所有宠物食品进口前，应取得农业农村部的“进口饲料登记证”，而进行申报的前提，是宠物食品所使用的原料成分，无论作为原料还是添加剂，必须在中国的《饲料原料目录》和《饲料添加剂目录》中，大麻二酚目前并不在。
6.现在有不法商贩销售掺杂了大麻二酚的宠物食品，尤其是宠物猫食品，以宣传可以防止跳蚤、使猫咪温顺等有效效果向消费者传递虚假信息。
7.现有检测大麻二酚的方法，在不同领域主要为以下四种：（1）sf∕z jd0107022
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2018 《毛发中&9
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四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚的液相色谱
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串联质谱检验方法》；（2）cn201910908205.2 一种纺织品中大麻二酚的检测方法；（3）cn202011241528.x 一种化妆品中大麻二酚的检测方法；（4）《hplc法测定火麻仁中大麻二酚的含量》。
8.以上方法中，液相色谱
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串联质谱检验方法对实验环境、设备、人员等要求比较高，只能适用于海关下属检验检测机构等，不适用于一般生产企业或经销商等，其他三种方法（包括两个专利方法与一个常规方法），均基于液质联用仪或液相仪，成本较高、检测难度大，对于少量检测需求成本过高。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法。
10.根据本发明的一个方面，提供了一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法，
包括以下：步骤a，称取一定量的待测样品，置于第一玻璃容器中，加入蒸馏水和提取剂，震荡后，进行超声提取，超声提取结束后，静置分层，取上层部分，得到第一样液，提取剂为乙酸乙酯或乙醚中的一种；待测样品中非法添加的大麻二酚被乙酸乙酯或乙醚经过超声提取，提取到上层部分，即第一样液中；步骤b，取一定量的第一样液，置于第二玻璃容器中，进行第一次旋转蒸发处理，将第一样液浓缩蒸干，向第二玻璃容器中加入无水乙醇溶解，溶解后再加入二氯甲烷混合均匀，得到第二样液；对第一样液进行第一次旋转蒸发处理，将其中的提取剂乙酸乙酯或乙醚挥发蒸干，然后依次加入无水乙醇和二氯甲烷进行溶解，待测样品为宠物食品，其中含有比较多的脂类物质，乙醇既可以较好的溶解大麻二酚，又具有很强的极性，与脂类差距较大，所以使用乙醇溶解可以尽可能的将第一样液中的大麻二酚溶解到有机溶液中，避免因为蒸干后被大量油脂包裹而影响提取率，可以提高对大麻二酚的提取率，进而提高本方法测定的准确率。
11.步骤c，向第二样液中加入盐酸溶液，进行第二次旋转蒸发处理，第二次旋转蒸发处理的水浴温度逐渐升高至一定温度，在该温度下以100
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150rpm的转速旋转蒸发处理30min，然后逐渐降低转速至50rpm，并依次加入呋喃甲醛、间苯二酚的乙醇溶液，然后调整转速至200rpm，温度为80℃保持10min，然后每5分钟降低10℃，直至降至50℃后保持温度不变，加入脱水剂后，继续反应15min，冷却至室温，得到第三样液，一定温度为80℃；盐酸溶液为反应提供酸性环境，便于呋喃甲醛与间苯二酚按照反应式（1）进行羰基加成反应，呋喃甲醛的醛基与间苯二酚的苯环上的双键发生加成反应，生成中间产物ι，中间产物ι与第二样液中的大麻二酚在酸性条件下，大麻二酚的酚羟基作为亲核试剂进攻已经质子化的羰基上的碳原子，由于质子的转移而生成中间产物ⅱ，加入脱水剂后，中间产物ⅱ失去h2o和醇羟基，按照反应式（3）进行分子内环化反应生成中间产物ⅲ，第三样液中含有中间产物ⅲ，反应式（1）~（3）如下：（1）（2）
（3）步骤d，取20ml第三样液吹干，得到待测产物，加入乙醚，充分复溶待测产物，得到待测样液，静置1min；对第三样液吹干，将第三样液中的盐酸溶液挥发，使第三样液中的中间产物ⅲ在非酸性环境下，受到三个彼此独立的芳香环作用脱去手性碳原子上的质子，形成大π环共轭体系，生成待测产物ⅳ，分子结构更加稳定。加入乙醚，对待测产物ⅳ进行复溶，得到待测样液，反应式（4）如下：（4）步骤e，取空白对照样品，重复步骤a~d，制备得到空白对照溶液，取待测样液和空白对照溶液，在一定波长条件下，测定吸光度，得到空白对照溶液的吸光度值和待测样液的吸光度值，波长为625nm波长；空白对照样品中不含有大麻二酚，加入的呋喃甲醛和间苯二酚按照步骤c和d，经过以下反应式（1）、（5）~（7），生成另一种待测产物
ⅴ
，空白对照溶液中含有待测产物
ⅴ
，在625nm波长条件下，分别对空白对照溶液和待测样液进行吸光度测定，得到空白对照溶液的吸光度值为0.3135；反应式（1）、（5）~（7）如下：
（1）（5）（6）（7）步骤f，当待测样液的吸光度值大于空白对照溶液的吸光度值时，判定为阳性，即待测样品中非法添加有大麻二酚；当待测样液的吸光度值等于空白对照溶液的吸光度值时，判定为阴性，即待测样品中没有非法添加大麻二酚。
12.以空白对照溶液的吸光度值为定性判定标准，是因为当待测样品中不含有大麻二酚时，按照步骤a~d操作，其反应过程与步骤e中空白对照样品的反应过程相同，即待测样品中不含有大麻二酚，加入的呋喃甲醛和间苯二酚生成的中间产物ι不会与大麻二酚发生反应，而是最后生成待测产物
ⅴ
，所以得到的待测样液的吸光度值与空白对照溶液的吸光度值是相同。
13.当待测样品中非法添加有大麻二酚时，按照步骤a~d操作，过量加入的呋喃甲醛和间苯二酚生成中间产物ι，中间产物ι相对于大麻二酚是过量的，部分中间产物ι进而与提取出的大麻二酚发生反应，剩余部分中间产物ι发生反应生成待测产物
ⅴ
，最后得到的待测样液中为待测产物ⅳ和
ⅴ
的混合物，在波长625nm下，待测产物ⅳ的吸光度大于待测产物
ⅴ
，
因此，待测样液的吸光度值大于空白对照溶液的吸光度值，说明待测样液中含有待测产物ⅳ，进而可以确定待测样品中添加有大麻二酚；待测样液的吸光度值等于空白对照溶液的吸光度值时，说明待测样液中只含有待测产物
ⅴ
，而不含有待测产物ⅳ，进而可以确定待测样品中没有添加大麻二酚或大麻二酚的添加量低于定量检出限，判定为阴性，即待测样品中没有添加大麻二酚。
14.本发明的有益效果：本发明的检测方法专属性强，将待测样品中的目标物大麻二酚通过化学反应转化为待测产物ⅳ和
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，测定吸光度值，以空白对照溶液的吸光度值为判定标准，对待测样液进行定性判定，即可确定待测样品中是否非法添加有大麻二酚。本发明针对性强，抗干扰能力强，检测结果灵敏度高，极大得降低了假阳性，检测用时短，检测过程不需要使用液相色谱仪等昂贵仪器，检测成本低，适用于终端检测。
15.在一些实施方式中，本发明还包括步骤g，取空白对照样品，向空白对照样品中，分别添加不同质量的大麻二酚，得到大麻二酚添加量分别为0.5g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg、2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg的系列添加对照样品，取系列添加对照样品，重复步骤a~d，制备得到添加对照溶液，在步骤e的波长条件下，测定添加对照溶液的吸光度，得到添加对照溶液的吸光度值，以大麻二酚梯度添加量0.5g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg、2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg为横坐标，以对应的添加对照溶液的吸光度值为纵坐标，得到添加量在0.5~5.0g/kg范围内的吸光度标准曲线，添加量为0.5g/kg的添加对照溶液的吸光度值0.496，待测样液的吸光度值大于等于0.496时，将待测样液的吸光度值带入标准曲线，计算得到待测样品中大麻二酚的添加量。本步骤对宠物食品中非法添加的大麻二酚进行定量测定，利用在空白对照样品中梯度添加大麻二酚，得到相应梯度添加量所对应的吸光度值，建立标准曲线。在0.5
‑
5.0g/kg的添加范围内，添加量与对应的吸光度值呈线性关系，因此在待测样液的吸光度值大于等于0.496时，将待测样液的吸光度值带入标准曲线内，计算得到待测样品中大麻二酚的添加量，实现对待测样品中大麻二酚的定量测定。在0
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0.5g/kg的添加范围内，添加量与对应的吸光度值不符合线性关系，无法对0
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0.5 g/kg的添加范围内，即待测样品的吸光度在0.3135
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0.496范围内时，无法对该待测样品进行定量测定，只能按照步骤f进行定性判定为阳性。
16.在一些实施方式中，待测样品为半固体宠物食品、乳状宠物食品、固体宠物食品或液体宠物食品中的一种。本发明的检测方法适用于对各种状态的宠物食品中是否添加有大麻二酚进行测定，检测结果的准确度不受宠物食品的状态影响。
17.在一些实施方式中，步骤a中第一玻璃容器为锥形瓶，步骤b中第二玻璃容器为圆底烧瓶。
18.在一些实施方式中，步骤b中第一次旋转蒸发的水浴温度为55℃
‑
60℃。第一次旋转蒸发的水浴温度为55℃
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60℃，便于将提取剂乙酸乙酯或乙醚蒸干，对提取出的大麻二酚进行浓缩。
19.在一些实施方式中，步骤c中盐酸溶液为1.0mol/l的盐酸溶液，间苯二酚的乙醇溶液中间苯二酚的质量分数为1%
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2%。 乙醇溶液用于溶解间苯二酚，便于准确控制间苯二酚的加入量。
20.在一些实施方式中，脱水剂为无水硫酸镁。无水硫酸镁作为脱水剂对中间产物ⅱ进行脱水处理，便于后续反应正常进行。
21.在一些实施方式中，步骤e中空白对照溶液的吸光度值为0.3135。空白对照样品中不含有大麻二酚，按照步骤a~d操作，加入的呋喃甲醛和间苯二酚生成的中间产物ι不会与大麻二酚发生反应，而是最后生成待测产物
ⅴ
，待测产物
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具有颜色，其溶解于空白对照溶液中，利用分光光度计测定空白对照溶液的吸光度值为0.3135，以该吸光度值作为定性判断的标准。
22.在一些实施方式中，标准曲线为y=0.365x 0.3135，r2=0.9998，检测方法对大麻二酚的定量检出限为0.5g/kg。本测定方法可以对添加量在0.5
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5.0g/kg范围内的大麻二酚进行准确定量测定，大麻二酚添加到宠物食品中起到镇静作用，因此添加量不会太高，本方法针对0.5
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5.0g/kg的添加量范围已经足够覆盖宠物食品实际添加大麻二酚的添加量。
附图说明
23.图1为本发明的一种实施方式的一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法的标准曲线。
具体实施方式
24.下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
25.实施例1本实施例中乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，乙醚选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙醚，二氯甲烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯二氯甲烷，盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯盐酸，无水乙醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯无水乙醇，呋喃甲醛选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯糠醛，间苯二酚选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯间苯二酚，无水硫酸镁选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯无水硫酸镁；1%
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2%的间苯二酚的乙醇溶液的配制：称取5
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10g间苯二酚放入烧杯中，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入500ml容量瓶，然后定容至刻度线；1.0mol/l的盐酸溶液的配制：量取43ml 36%盐酸倒入烧杯，用蒸馏水溶解后，用玻璃棒引流注入500ml容量瓶，然后定容至刻度线；以下实施例2
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7均采用本实施例1中的试剂。
26.实施例2本发明的一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法，包括以下：步骤a，称取5.0g固体宠物食品作为待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入50ml蒸馏水和50ml提取剂乙酸乙酯，震荡10min后，进行超声提取5min，超声提取结束后，静置分层，取出上层即乙酸乙酯层溶液，作为第一样液；步骤b，取25ml的第一样液，置于圆底烧瓶中，调节水浴温度为55℃，进行第一次旋转蒸发处理，将第一样液浓缩蒸干，取下圆底烧瓶，向其中加入3ml无水乙醇溶解，溶解后再加入100ml二氯甲烷混合均匀，得到第二样液；步骤c，向第二样液中加入0.5ml浓度为1.0mol/l的盐酸溶液，进行第二次旋转蒸发处理，水浴温度由25℃逐渐升高至80℃，在该温度下以100rpm的转速旋转蒸发处理30min，然后逐渐降低转速至50rpm，并向圆底烧瓶中依次加入0.2ml呋喃甲醛、2ml质量分数
1%的间苯二酚的乙醇溶液，然后调整转速至200rpm，在温度为80℃条件下旋转蒸发10min，然后每5分钟降低10℃，直至降至50℃后保持温度不变，加入2g无水硫酸镁进行脱水处理，继续反应15min，冷却至室温，得到第三样液；步骤d，取20ml第三样液置于50ml离心管中吹干，使用氮气吹干，得到待测产物，向50ml离心管中加入2.5ml乙醚，充分复溶待测产物，得到待测样液，静置1min；步骤e，取5.0g空白对照样品，重复步骤a~d，制备得到空白对照溶液，各取1ml待测样液和1ml空白对照溶液分别放置于比色皿中，在625nm波长条件下，测定吸光度，得到空白对照溶液的吸光度值为0.3135，待测样液的吸光度值为0.5694；步骤f，待测样液的吸光度值为0.5694大于空白对照溶液的吸光度值0.3135，判定为阳性，即待测样品中非法添加有大麻二酚。
27.实施例3本发明的一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法，包括以下：步骤a，称取5.0g乳状宠物食品作为待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入75ml蒸馏水和75ml提取剂乙酸乙酯，震荡10min后，进行超声提取5min，超声提取结束后，静置分层，取出上层即乙酸乙酯层溶液，作为第一样液；步骤b，取30ml的第一样液，置于圆底烧瓶中，调节水浴温度为60℃，进行第一次旋转蒸发处理，将第一样液浓缩蒸干，取下圆底烧瓶，向其中加入5ml无水乙醇溶解，溶解后再加入100ml二氯甲烷混合均匀，得到第二样液；步骤c，向第二样液中加入1.0ml浓度为1.0mol/l的盐酸溶液，进行第二次旋转蒸发处理，水浴温度由25℃逐渐升高至80℃，在该温度下以150rpm的转速旋转蒸发处理30min，然后逐渐降低转速至50rpm，并向圆底烧瓶中依次加入0.5ml呋喃甲醛、2ml质量分数1%的间苯二酚的乙醇溶液，然后调整转速至200rpm，在温度为80℃条件下旋转蒸发10min，然后每5分钟降低10℃，直至降至50℃后保持温度不变，加入5g无水硫酸镁进行脱水处理，继续反应15min，冷却至室温，得到第三样液；步骤d，取20ml第三样液置于50ml离心管中吹干，使用氮气吹干，得到待测产物，向50ml离心管中加入2.5ml乙醚，充分复溶待测产物，得到待测样液，静置1min；步骤e，取5.0g空白对照样品，重复步骤a~d，制备得到空白对照溶液，各取1ml待测样液和1ml空白对照溶液分别放置于比色皿中，在625nm波长条件下，测定吸光度，得到空白对照溶液的吸光度值为0.3135，待测样液的吸光度值为0.3135；步骤f，待测样液的吸光度值为0.3135与空白对照溶液的吸光度值0.3135相同，判定为阴性，即待测样品中没有非法添加大麻二酚。
28.实施例4本发明的一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法，包括以下：步骤a，称取5.0g液体宠物食品作为待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入62.5ml蒸馏水和62.5ml提取剂乙醚，震荡10min后，进行超声提取5min，超声提取结束后，静置分层，取出上层即乙醚层溶液，作为第一样液；步骤b，取27.5ml的第一样液，置于圆底烧瓶中，调节水浴温度为57.5℃，进行第一次旋转蒸发处理，将第一样液浓缩蒸干，取下圆底烧瓶，向其中加入4ml无水乙醇溶解，溶解后再加入100ml二氯甲烷混合均匀，得到第二样液；
步骤c，向第二样液中加入0.5ml浓度为1.0mol/l的盐酸溶液，进行第二次旋转蒸发处理，水浴温度由25℃逐渐升高至80℃，在该温度下以100rpm的转速旋转蒸发处理30min，然后逐渐降低转速至50rpm，并向圆底烧瓶中依次加入0.2ml呋喃甲醛、2ml质量分数1%的间苯二酚的乙醇溶液，然后调整转速至200rpm，在温度为80℃条件下旋转蒸发10min，然后每5分钟降低10℃，直至降至50℃后保持温度不变，加入2g无水硫酸镁进行脱水处理，继续反应15min，冷却至室温，得到第三样液；步骤d，取20ml第三样液置于50ml离心管中吹干，使用氮气吹干，得到待测产物，向50ml离心管中加入2.5ml乙醚，充分复溶待测产物，得到待测样液，静置1min；步骤e，取5.0g空白对照样品，重复步骤a~d，制备得到空白对照溶液，各取1ml待测样液和1ml空白对照溶液分别放置于比色皿中，在625nm波长条件下，测定吸光度，得到空白对照溶液的吸光度值为0.3135，待测样液的吸光度值为1.3737；步骤f，待测样液的吸光度值为1.3737大于空白对照溶液的吸光度值0.3135，判定为阳性，即待测样品中非法添加有大麻二酚。
29.步骤g，取七份空白对照样品，每份质量为5.0g，向七份空白对照样品中分别对应添加不同质量的大麻二酚，得到大麻二酚添加量分别为0.5g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg、2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg的系列添加对照样品，取系列添加对照样品，重复步骤a~d，制备得到添加对照溶液，在步骤e的波长条件下，测定添加对照溶液的吸光度，得到添加对照溶液的吸光度值，以大麻二酚梯度添加量0.5g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg、2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg为横坐标，以对应的添加对照溶液的吸光度值为纵坐标，计算得到添加量在0.5~5.0g/kg范围内的吸光度标准曲线，标准曲线为：y=0.365x 0.3135，r2=0.9998。本方法的标准曲线适用于大麻二酚添加量范围为0.5
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5.0g/kg，即待测样液的吸光度值大于等于0.496时，才能适用该标准曲线，本实施例待测样液的吸光度值1.3737大于0.496，将待测样液的吸光度值1.3737带入标准曲线，计算得到待测样品中大麻二酚的添加量为2.9g/kg。
30.实施例5本发明的一种宠物食品中非法添加大麻二酚的检测方法，包括以下：步骤a，称取5.0g半固体宠物食品作为待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入75ml蒸馏水和62.5ml提取剂乙酸乙酯，震荡10min后，进行超声提取5min，超声提取结束后，静置分层，取出上层即乙酸乙酯层溶液，作为第一样液；步骤b，取30ml的第一样液，置于圆底烧瓶中，调节水浴温度为60℃，进行第一次旋转蒸发处理，将第一样液浓缩蒸干，取下圆底烧瓶，向其中加入5ml无水乙醇溶解，溶解后再加入100ml二氯甲烷混合均匀，得到第二样液；步骤c，向第二样液中加入1.0ml浓度为1.0mol/l的盐酸溶液，进行第二次旋转蒸发处理，水浴温度由25℃逐渐升高至80℃，在该温度下以100rpm的转速旋转蒸发处理30min，然后逐渐降低转速至50rpm，并向圆底烧瓶中依次加入0.5ml呋喃甲醛、2ml质量分数1%的间苯二酚的乙醇溶液，然后调整转速至200rpm，在温度为80℃条件下旋转蒸发10min，然后每5分钟降低10℃，直至降至50℃后保持温度不变，加入5g无水硫酸镁进行脱水处理，继续反应15min，冷却至室温，得到第三样液；步骤d，取20ml第三样液置于50ml离心管中吹干，使用氮气吹干，得到待测产物，向
g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg的系列添加对照样品，取系列添加对照样品，重复步骤a~d，制备得到添加对照溶液，在步骤e的波长条件下，测定添加对照溶液的吸光度，得到添加对照溶液的吸光度值，以大麻二酚梯度添加量0.5g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg、2.0 g/kg、2.5 g/kg、3.5 g/kg、5.0 g/kg为横坐标，以对应的添加对照溶液的吸光度值为纵坐标，计算得到添加量在0.5~5.0g/kg范围内的吸光度标准曲线，标准曲线为：y=0.365x 0.3135，r2=0.9998。本实施例的待测样液的吸光度为0.496，适用于该标准曲线，将本实施例的待测样液的吸光度值0.496带入该标准曲线，计算得到待测样品中大麻二酚的添加量为0.5g/kg。本方法对非法添加的大麻二酚的定量检出限为0.5g/kg。
34.本发明的检测方法相比于现有检测方法，检测操作简便、快速，灵敏度高，不需要大型分析仪器，不需要使用剧毒或致癌等危险试剂，对实验环境及人员的危害性低，将目标物大麻二酚经过反应转化为待测产物ⅳ和
ⅴ
，进行分光光度检测，针对性强，抗干扰能力强，极大的降低了假阳性情况发生，提高了定性判定和定量测定的准确度，适用于终端快速筛查。
35.以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。