一种无标记三维超分辨显微方法与装置与流程

技术特征：
1.一种无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，包括步骤：(1)利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图i
s
(x,y,z0,0)和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图i
k
(x,y,z0,0)；(2)根据公式i
f
(x,y,z0,0)＝i
s
(x,y,z0,0)
‑
αi
k
(x,y,z0,0)得到横向超分辨图像i
f
(x,y,z0,0)，其中α为权重因子，(3)采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离
‑
u
m
处，另一个光电探测器置于焦平面的离焦距离 u
m
处，分别测得反映样品表面形貌变化大小的强度曲线i
a
(x,y,z,
‑
u
m
)和i
b
(x,y,z, u
m
)，进行差动相减并进行归一化处理，后得到一个差分强度信号i
d
(x,y,z,u
m
)；(4)优化u
m
值，根据强度曲线i
d
(x,y,z,u
m
)在零点附近ab线性测量范围内的光强大小，重构出样品表面形貌和微观尺度；(5)通过结合横向超分辨图像信息和轴向差动测量信息得到三维超分辨显微图像。2.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤(1)和(3)中，利用雪崩光电二极管(apd)或光电倍增管(pmt)收集反射的激光强度信号。3.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，步骤(2)内的公式差分出现负值时，计算结果直接归零。4.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，利用两个激光器发出波长接近但不相同的激光，分别形成所述的实心照明光束和空心照明光束。5.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，一路激光为波长为405nm；另一路激光波长为450nm。6.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，i
s
(x,y,z,0)和i
k
(x,y,z,0)在计算时均取归一化强度分布，α为权重因子。7.根据权利要求1所述的无标记三维超分辨显微方法，其特征在于，通过设置两路探测光路，并将探测器分别向相反方向偏离相同距离 u
m
和
‑
u
m
。8.一种无标记三维超分辨显微成像装置，其特征在于，两个激光器发出波长接近但不相同的激光，二色镜能透过一个激光器发出的较短波长的光，反射另一个激光器发出的较长波长的光，两路激光通过二色镜后进入振镜模块同时对样品进行扫描；其中用405nm激光扫描得到i
k
(x,y,z0,0)，用450nm激光扫描得到i
s
(x,y,z0,0)、i
a
(x,y,z,
‑
u
m
)、i
b
(x,y,z, u
m
)，或者用405nm激光扫描得到i
s
(x,y,z0,0)、i
k
(x,y,z0,0)，用450nm激光扫描得到i
a
(x,y,z,
‑
u
m
)、i
b
(x,y,z, u
m
)，通过波长不同分离出两路信号。

技术总结
本发明公开一种无标记三维超分辨显微方法，包括步骤：利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图，并进行差分计算；采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离


技术研发人员：匡翠方 张宇森 何敏菲 周国尊 刘旭 李海峰
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.05.31
技术公布日：2021/10/23