常压下带喷针的毛细管液相色谱一体柱制备方法与流程

1.本发明涉及毛细管领域，具体是常压下带喷针的毛细管液相色谱一体柱制备方法。


背景技术：

2.液相色谱
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质谱联用技术已经成为蛋白质组、脂质组、多肽组样品分析的最常使用的工具。大多数实验室采用自己装填的毛细管色谱柱，装填方法有电动填充法，气压匀浆填充法和液压匀浆填充法。
3.而气压法则主要利用高压氮气瓶提供压力，将匀浆好的填料通过气压直接压入拉好喷针的毛细管柱，但是该方法不适用于长度超过20cm色谱柱的填充，液压法则利用高压泵将匀浆好的填料压入拉好喷针的毛细管柱中。该方法需要昂贵的设备，同样难以装填超过50cm的长毛细管色谱柱。因此，本领域技术人员提供了常压下带喷针的毛细管液相色谱一体柱制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供常压下带喷针的毛细管液相色谱一体柱制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：所述将液相色谱填料匀浆后，在常压下利用装填设备将填料装入毛细管中，然后将装有填料的毛细管柱一端用硅橡胶封住，在毛细管色谱柱的另一端用加热拉制喷针，从而形成一体柱，最后将该一体柱连接到色谱仪，利用高压泵将填料床层压实，截掉毛细管柱的空管部分，完成色谱柱的制备。
6.作为本发明进一步的方案：所述匀浆剂为甲醇、丙酮、乙醇、异丙醇或氯仿，色谱填料为1.7
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10 μm粒径的c18、c8、c4反相色谱填料以及氨基、羟基的亲水色谱填料，匀浆剂和填料的质量比为1:1
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10:1（w/w）。
7.作为本发明再进一步的方案：所述毛细管外径为360
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380 μm，内径为50 μm、75 μm、100 μm、150 μm、200 μm和250 μm内径的石英毛细管。
8.作为本发明再进一步的方案：所述装填设备有两个部分组成，色谱进样针、二通接头、连接头和套管，通过二通接头将毛细管和进样器连接起来，色谱进样针吸取匀浆好的色谱填料通过这一装置注射到毛细管柱中。
9.作为本发明再进一步的方案：所述加热方法为激光加热拉制或火焰加热拉制，加热的位置为毛细管未封口一端距出口5
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10cm处。
10.作为本发明再进一步的方案：所述高压泵将色谱填料装入毛细管柱后，将毛细管柱连接到色谱仪系统，利用色谱仪的高压泵将乙腈、甲醇或水流过色谱柱，使其中的色谱填料流向喷针方向，从而完成色谱填料床层的压实。高压泵压力为10
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100 mpa。
11.作为本发明再进一步的方案：所述加热利用酒精喷灯或高温喷火枪，利用其外焰
加热毛细管柱，通过拉力将毛细管柱受热部分拉制成喷针；又可以利用激光拉针仪，利用激光进行加热，通过拉力使其形成喷针。
附图说明
12.图1为本发明的填装毛细管柱示意图；图2为本发明的烧结拉制毛细管柱示意图；图3为本发明中切割毛细管柱示意图；图4为本发明中毛细管色谱柱连续上样3次的总离子流图； 图5为保留时间靠前、居中、靠后三个位置提取的离子色谱峰峰宽示意图。
具体实施方式
13.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
14.请参阅图1～4，本发明实施例中，常压下带喷针的毛细管液相色谱一体柱制备方法，将液相色谱填料匀浆后，在常压下利用装填设备将填料装入毛细管中，然后将装有填料的毛细管柱一端用硅橡胶封住，在毛细管色谱柱的另一端用加热拉制喷针，从而形成一体柱，最后将该一体柱连接到色谱仪，利用高压泵将填料床层压实，截掉毛细管柱的空管部分，完成色谱柱的制备。
15.其中，匀浆剂为甲醇、丙酮、乙醇、异丙醇或氯仿，色谱填料为1.7
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10 μm粒径的c18、c8、c4反相色谱填料以及氨基、羟基的亲水色谱填料，匀浆剂和填料的质量比为1:1
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10:1（w/w）；毛细管外径为360
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380 μm，内径为50 μm、75 μm、100 μm、150 μm、200 μm和250 μm内径的石英毛细管；装填设备有两个部分组成，色谱进样针、二通接头、连接头和套管，通过二通接头将毛细管和进样器连接起来，色谱进样针吸取匀浆好的色谱填料通过这一装置注射到毛细管柱中；加热方法为激光加热拉制或火焰加热拉制，加热的位置为毛细管未封口一端距出口5
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10cm处；高压泵将色谱填料装入毛细管柱后，将毛细管柱连接到色谱仪系统，利用色谱仪的高压泵将乙腈、甲醇或水流过色谱柱，使其中的色谱填料流向喷针方向，从而完成色谱填料床层的压实。高压泵压力为10
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100 mpa；加热利用酒精喷灯或高温喷火枪，利用其外焰加热毛细管柱，通过拉力将毛细管柱受热部分拉制成喷针；又可以利用激光拉针仪，利用激光进行加热，通过拉力使其形成喷针。
16.本发明的工作原理是：首先将色谱填料做成匀浆，匀浆剂与色谱填料的质量比为1:1
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10:1。色谱填料为反相色谱填料或亲水填料，匀浆剂为甲醇、乙醇、异丙醇、氯仿等，色谱填料既可以为1.7
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10 μm的c18、c8和c4的反相填料，也可以为氨基、羟基的亲水色谱填料，混合后，用超声法超声3
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5 min后，形成均匀的悬浊液。将色谱填料加入到离心管里，加入匀浆剂，超声使填料形成均匀的悬浊液，将色谱填料匀浆后，用进样针抽取一定量的含有填料的悬浊液，进样针为色谱进样最常用的微量进样器，体积为50
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500 μl。二通接头可以为常用的金属二通也可以为peek二通。毛细管为常用的石英毛细管，内径为50
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250 μm，外径为365
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380 μm。毛细管的长度依据实验需要，选择在0.1
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2 m范围内任意长度。填满的毛
细管柱用硅橡胶封住其中一端，另一端不用密封，通过二通接头与毛细管连接。将该悬浊液推入毛细管内，至毛细管内充满含填料的悬浊液。取下毛细管，将毛细管的入口用硅橡胶堵住，并在毛细管出口测5
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10 cm左右处，利用拉针仪或火焰加热拉制形成喷针，形成一体柱，一体柱是在未密封的毛细管一端，在距毛细管出口5
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10cm处加热拉制喷针。拉制好的喷针通常可以直接使用，如果喷针内径过小，可以使用陶瓷刀进行修剪，取下毛细管入口端的硅橡胶塞，连接到色谱仪，利用一定的压力将色谱填料压实，色谱柱压实，则是将拉好喷针的一体柱利用色谱仪的高压泵将填料压实。由于装填过程并未有压力，所以填料的床层较为松散，而拉好喷针后，通过高压泵可以将填料压到喷针一侧。通过这步操作，填料床层更加紧密，根据实验需要，截取填充有填料的毛细管部分，形成最终的毛细管柱。既可以使用恒压模式，也可以使用恒流模式产生处10
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100 mpa的压力，截掉毛细管柱的空管部分，完成色谱柱的装填。
17.实施例一：称取100 ug 3 μm 粒径（孔径120a）的c18 填料，将其混悬于200 ul甲醇。用超声3分钟形成均匀的悬浊液，用微量进样器吸取100ul，将二通接头的一端连接色谱进样针，另一端连接内径为200um的石英毛细管，将吸取好的匀浆液缓慢均匀的注射到毛细管柱中，将填满的毛细管柱用硅橡胶封住其中一端，另一端不密封，在未密封的毛细管一端距毛细管出口5cm处于高温喷火枪外焰进行加热，待加热部分软化后，快速拉开毛细管柱，形成喷针，将拉好喷针的一体柱使用色谱仪的高压泵在恒压模式下将填料压实，取下压好的毛细管柱，在距离填料的0.5 cm 处的位置，用陶瓷刀进行切割，形成最终的毛细管柱。此次拉制的色谱柱规格为15cm
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200um。大肠杆菌酶切产物制备：1）细菌蛋白提取：用pbs湿润棉签蘸取适量大肠杆菌置于裂解液（尿素：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=50：1：1）中，超声破碎提取蛋白，静置离心，取上清，测浓度。2）蛋白酶解： 取100ug大肠杆菌蛋白，加入2ul 100mm 三(2
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羧乙基)膦盐酸盐（tcep），56℃恒温震荡1h,将其还原。还原结束后，加入2ul200mm 氯乙酰胺（caa），避光30min，进行烷基化。最后加入胰蛋白酶（蛋白：胰蛋白酶=50：1），37℃恒温水浴24h。3）脱盐。4）冻干并复溶。
18.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
19.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
20.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。