一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质C和杂质D的检测方法与流程

一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测方法
技术领域
1.本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测方法。


背景技术：

2.银屑病是一种发病率较高的自身免疫疾病，俗称“牛皮癣”。其病症主要为表皮增殖和炎症，特点是角质形成细胞的增殖和分化加速，原位自身反应性t细胞增加以及血管生成和扩张。银屑病表皮处于过度增殖状态，皮肤表皮的动态平衡以加速的方式维持。银屑病表皮的增殖速率是正常表皮的30倍。由于表皮基底层的细胞密度增大，当密度超过一定阈值时，具有快速增殖能力的短暂扩增细胞被向外推移，从而引发增殖层扩大和真皮乳头的加深，真皮乳头的伸缩使基底层细胞产生强的收缩力，这种作用进一步将分化的细胞和短暂扩增细胞推出基底层，使之失去与真皮的连接而迅速角质化。在这种作用下，银屑病表皮的角质化现象加速，表皮的更新时间也显著缩短。银屑病主要分为四种类型：寻常型、脓疱型、关节病型以及红皮病型。其中寻常型银屑病发病率最高，约占整个患病人群的85~90%。
3.卡泊三醇是一种维生素d3衍生物，对1,25
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(oh)2
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d3受体有较强的亲合力，具有抑制角质形成细胞增殖和促进角质形成细胞分化成熟及抑制炎症反应等药理作用。
4.研究发现，卡泊三醇会降解产生杂质c、杂质d，卡泊三醇在溶液中会部分转化成前卡泊三醇（卡泊三醇和前卡泊三醇均作为药物活性成分），化学结构式分别如下：杂质c：杂质d：前卡泊三醇：
目前卡泊三醇软膏已在国内上市，已被英国药典和和美国药典收录，尚未被中国药典收录。药典正文中检查项下有对杂质c和杂质d进行控制，但是均未提及前卡泊三醇以及考察其与杂质c、杂质d的有效分离。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
6.本发明提供的一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱仪进行检测，且所述方法包括如下步骤：（1）溶液的配制：配制供试品溶液；根据所述的供试品溶液，使用流动相a和流动相b的混合液对其进行稀释，制得对照品溶液；（2）量取供试品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图；（3）取杂质c、杂质d和卡泊三醇对照品适量，用流动相溶解并稀释，摇匀，作为系统适用性溶液；（4）量取系统适用性溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
7.其中：相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5。
8.在某些实施方案中，步骤（1）中供试品溶液的配制方法为：将卡泊三醇软膏溶于流动相a和流动相b的混合液中，加入正庚烷后振摇静置分层，取下层溶液进行过滤，进而得到所述供试品溶液。
9.在某些实施方案中，步骤（1）中供试品溶液的具体配制方法为：取卡泊三醇软膏适量，置一具塞锥形瓶中，加入20ml流动相，置约70℃的水浴中加热融化，精密加入10ml正庚烷，振摇后静置分层，取下层溶液进行滤过，取续滤液作为供试品溶液。
10.在某些实施方案中，杂质的检测限度为：杂质c和杂质d的峰面积均不得大于对照溶液主峰面积。
11.在某些实施方案中，高效液相色谱仪测定时采用等度洗脱。
12.在某些实施方案中，流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为水，流动相b为乙腈，流动相a和流动相b的体积比为45:55。
13.在某些实施方案中，色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
14.在某些实施方案中，色谱柱的柱长为50至300mm。
15.在某些实施方案中，色谱柱的柱长为250mm。
16.在某些实施方案中，直径为1至10mm。
17.在某些实施方案中，直径为4.6mm。
18.在某些实施方案中，填料粒径为1至10μm。
19.在某些实施方案中，填料粒径为5μm。
20.在某些实施方案中，经过所述色谱柱的流速为0.5至1.5ml/mim。
21.在某些实施方案中，经过所述色谱柱的流速为1.0 ml/mim。
22.在某些实施方案中，进样体积为10至50μl。
23.在某些实施方案中，进样体积为20μl。
24.在某些实施方案中，色谱柱柱温为20至40℃。
25.在某些实施方案中，色谱柱柱温为30℃。
26.在某些实施方案中，分析测定采用的检测器选自紫外检测器。
27.在某些实施方案中，紫外检测器的检测波长为200至300nm。
28.在某些实施方案中，紫外检测器的检测波长为264nm。
29.有益效果：本发明经过对高效液相色谱分析中的色谱柱、流动相等条件进行筛选，选用合适的流动相体系，保证稀释剂和辅料不干扰样品中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测，保证前卡泊三醇、杂质c、杂质d和卡泊三醇色谱峰之间的分离度符合要求，最终建立了等度洗脱的hplc分析方法，实现了对卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的检测与控制。本发明严格控制药品质量，保证药品的安全性和有效性。本发明的检测方法对严格控制药品质量以及保证药品的安全性和有效性具有积极的作用。
30.附图说明
31.图1是实施例2检测卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的系统适用性溶液图。
具体实施方式
32.下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
33.实施例1依照高效液相色谱法测定（中国药典2020年版通则0512）。
34.色谱条件：采用高效液相色谱仪，色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱的柱长250mm、直径为4.6mm、填料粒径为5μm；经过所述色谱柱的流速为1.0 ml/mim、进样体积为20μl、色谱柱柱温为30℃；分析测定采用的检测器选自紫外检测器，紫外检测器的检测波长为264nm；采用等度洗脱，流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为水，流动相b为乙腈，流动相a和流动相b的体积比为45:55。
35.测定法：溶液的配制：取卡泊三醇软膏适量，置一具塞锥形瓶中，加入20ml流动相，置约70℃的水浴中加热融化，精密加入10ml正庚烷，振摇后静置分层，取下层溶液进行滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml置100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液。
36.实施例2 检测卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的系统适用性溶液试验取杂质c、杂质d和卡泊三醇等对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含杂质c 0.005mg、杂质d 0.005mg、卡泊三醇1mg的混合溶液，摇匀，作为系统适用性溶液。精密量取50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，前卡泊三醇、杂质c、卡泊三醇和杂质d依次出峰，相邻色谱峰之间的分离度均不小于1.5。各组分的保留时间如图1所示，试验结果如下：组分保留时间（min）相对保留时间分离度前卡泊三醇10.2830.88
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杂质c10.7800.921.60卡泊三醇11.7331.002.71杂质d14.3301.226.00本发明采用上述条件，可以将卡泊三醇软膏中杂质c、杂质d和卡泊三醇都检测出来，各组分的峰分离度均＞1.5，也就是说本发明能够将杂质c、杂质d和卡泊三醇都很好的分离。
37.实施例3 一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的定量限试验分别取杂质c、杂质d和卡泊三醇对照品各适量，置于容量瓶中，用稀释剂溶解并制成每ml含杂质c、杂质d和卡泊三醇均为10ng的溶液，用稀释剂逐步稀释至s/n不低于10.0，该浓度溶液作为定量限溶液，平行配制六份。精密量取各溶液50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果如下：名称定量限溶液（μg/ml）浓度水平（%）杂质c0.00240.04杂质d0.00250.04卡泊三醇0.00250.04实施例4 一种卡泊三醇软膏中前卡泊三醇、杂质c和杂质d的线性试验分别取杂质c、杂质d和卡泊三醇对照品各适量，置于容量瓶中，用稀释剂溶解并制成每ml含杂质c、杂质d和卡泊三醇均为600ng的溶液，作为线性贮备液；分别移取4.0ml、3.0ml、2.0ml、1.6ml、1.0ml、0.4ml线性贮备液至20ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，分别作为200%、150%、100%、80%、50%、20%的线性溶液。精密量取各溶液50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
38.杂质c的线性试验结果如下：限度水平（%）浓度（μg/ml）峰面积200.01220.069500.03050.139800.04880.221000.06100.2771500.09150.4052000.12190.522杂质d的线性试验结果如下：限度水平（%）浓度（μg/ml）峰面积200.01250.054
500.03130.126800.05010.1961000.06270.2451500.09400.3672000.12530.482卡泊三醇的线性试验结果如下：限度水平（%）浓度（μg/ml）峰面积200.01270.064500.03160.142800.05060.2271000.06330.2781500.09490.4092000.12660.540杂质c在0.0122μg/ml~0.1219范围内，溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=4.1828x 0.0169，线性相关系数r=0.996；杂质d在0.0125μg/ml~0.1253范围内，溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=3.8066x 0.0065，线性相关系数r=1.000；卡泊三醇在0.0127μg/ml~0.1266范围内，溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=4.1813x 0.0121，线性相关系数r=1.000。
39.综上所述：本发明的方法精密度较好，结果准确灵敏、可靠，适用范围广；同时，本发明的方法简单易行，成本低，适合推广使用。
40.以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。