一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法与流程

1.本发明涉及一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法。


背景技术：

2.氯化石蜡(cps)是一类氯代烷烃类混合物，主要应用于金属加工业和塑料工业。它是我国产地环境和农产品污染最严重的卤代有机污染物之一。根据碳链长度，氯化石蜡可分为短链氯化石蜡(sccps，c
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)、中链氯化石蜡(mccps，c
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)和长链氯化石蜡(lccps，c
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)。研究显示，氯化石蜡对动物具有生殖毒性和发育毒性。
3.现有技术中，通过动物肝微粒体离体代谢卤代有机污染物是研究其在动物体内代谢转化机制的重要手段，后者是评价其生物毒性大小的重要因素。但目前尚无肝微粒体离体代谢氯化石蜡的报道。现时肝微粒体离体代谢卤代有机污染物的方法包括以下步骤：采用dmso溶解卤代有机污染物；在反应体系中加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体、卤代有机污染物的dmso溶液；将反应体系置于37℃水浴锅预孵化5min后，加入nadph酶再生体系，反应开始计时；然后加入冷甲醇终止反应，再加入有机溶剂萃取三次，合并萃取液，氮吹干后，加入初始流动相复溶，上机检测卤代有机污染物。值得注意的是，由于dmso对酶具有一定的毒性，反应体系中dmso的体积不得超过最终反应体系的1％。所以，由于底物溶液体积在最终反应系统中所占比例如此之小，为了准确量取底物溶液，并且考虑尽可能的节约反应原料，现有技术中最终反应体系通常设置为1ml。
4.氯化石蜡在动物体内代谢清除规律的研究是探讨其生物富集性的关键因素，后者是氯化石蜡对生态/健康风险评估的重要因素。测定卤代有机污染物的肝微粒体离体代谢清除率是模拟其在动物体内代谢清除规律的常用方法。但是采用现时的肝微粒体离体代谢卤代有机污染物的方法对氯化石蜡进行实验，难以测定其代谢清除率。这是由于现时检测氯化石蜡浓度的方法的灵敏度相对较低，需要采用较高浓度的氯化石蜡作为底物进行实验才能满足后续检测的需求；但由于肝微粒体代谢能力有限，其对底物的代谢清除率通常随着底物浓度的增加而降低，在参考其他卤代有机污染物的肝微粒体代谢条件时，即使采用能够满足氯化石蜡后续检测方法的最低浓度0.2μg/ml，也很难观察到氯化石蜡的消耗。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，实现肝微粒体离体代谢氯化石蜡的代谢清除率的测定。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法，包括以下步骤：
8.(1)将氯化石蜡溶于有机溶剂，得到氯化石蜡溶液，并向其中加入血清，静置平衡后得到底物体系；
9.(2)向底物体系先后加入磷酸钾缓冲溶液、肝微粒体和nadph酶再生体系，摇匀后得到最终反应体系，然后置于37℃水浴中振荡反应；
10.(3)向步骤(2)的反应体系加入冰冷的有机溶剂终止反应，然后进行离心，取上层清液，测定氯化石蜡含量。
11.本发明向氯化石蜡溶液加入血清，并静置平衡，使得高度疏水的氯化石蜡与血清有效结合，在后续反应中血清作为氯化石蜡的载体，促进氯化石蜡与肝微粒体蛋白酶反应，提高氯化石蜡的代谢清除率。
12.所述步骤(1)血清加入的体积为氯化石蜡溶液的1～10倍。
13.所述步骤(1)中静置平衡的过程在4℃下进行6～12h，或在室温下进行1～3h。
14.所述有机溶剂为乙腈，采用乙腈作为氯化石蜡的溶剂，相对于dmso，其对酶的毒性较低，有利于肝微粒体蛋白酶在反应体系中保持活性。
15.所述步骤(1)中有机溶剂的体积在最终反应体系中所占比例不超过5％。
16.所述最终反应体系中氯化石蜡的浓度为0.2～1.0μg/ml。
17.所述步骤(2)中最终反应体系的总体积为0.4～0.6ml。
18.所述步骤(2)中的反应时间为0.5～6h。
19.所述步骤(3)中采用超高效液相色谱
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电喷雾离子源
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高分辨质谱仪(uplc
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esi
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hrms)测定氯化石蜡含量；uplc
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esi
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hrms有相对较高的分辨率，能够有效剔除基质干扰，使得本发明不需要通过有机溶剂提取剔除极性较大的基质。
20.所述步骤(3)中，在4℃和10000rpm/min的转速下，离心5min。
21.本发明具有以下有益效果：
22.本发明采用血清作为氯化石蜡的载体，促进氯化石蜡与肝微粒体反应，显著提高氯化石蜡的代谢清除率，实现肝微粒体离体代谢氯化石蜡的代谢清除率的测定。由于氯化石蜡的检测方法灵敏度相对较低，肝微粒体离体代谢实验的反应体系中，氯化石蜡的浓度不低于0.2μg/ml才能满足后续仪器检测的需求；在现有方法中，该浓度条件下是无法观察到氯化石蜡的代谢清除率；然而，该浓度条件下采用本发明方法能观察到显著的代谢清除率，有利于了解氯化石蜡在动物体内代谢清除规律。
23.血清作为氯化石蜡的载体后，有机溶剂在最终反应体系中所占比例提高到5％，所以可将最终反应体系的总体积降低到0.4～0.6ml，因而节约了底物、肝微粒体、nadph酶再生体系等反应原料的使用量，达到降低反应成本的目的。
24.另外，本发明方法省去了加入nadph酶再生体系前的预孵化步骤以及反应结束后的净化步骤，操作更简洁，更适合于批量操作。
附图说明
25.图1是本发明肝微粒体离体代谢氯化石蜡的方法的流程图。
具体实施方式
26.以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
27.实施例1
28.鸡肝微粒体离体代谢短链氯化石蜡(sccps)
29.(1)取1μl的sccps
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乙腈溶液置于1.5ml一次性离心管底部，加入10μl鸡血清，震荡，轻微涡旋，4℃下静置平衡12h；
30.(2)依次加入345μl的ph值为7.4的磷酸钾缓冲溶液、12.5μl鸡肝微粒体、以及nadph酶再生体系中的a溶液25μl和b溶液5μl，摇匀，迅速置于37℃水浴振荡反应0.5h；
31.(3)加入冰冷的400μl乙腈终止反应，在4℃下用10000rpm/min转速离心5min，然后取500μl上清液至进样瓶中，用uplc
‑
esi
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hrms测定sccps分子式同系物的含量，结果见表1。表1为氯原子数为7的不同碳链的sccps以及碳原子数为12的不同氯原子数的sccps的代谢清除率，其中底物浓度指步骤(2)中最终反应体系中sccps的浓度。
32.表1
[0033][0034][0035]
表1的结果显示，相同浓度sccps条件下，鸡肝微粒体对相同氯原子的不同碳链的sccps的代谢清除率大小顺序为：c
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>c
11
>c
12
>c
13
；鸡肝微粒体对相同碳原子数的不同氯原子数的sccps的代谢清除率大小顺序为：cl5>cl6>cl7>cl8>cl9；对于相同碳原子数和氯原子数的sccps，其代谢清除率随着底物浓度的增加而降低。
[0036]
实施例2
[0037]
鸡肝微粒体离体代谢中链氯化石蜡(mccps)
[0038]
(1)取12μl的mccps乙腈溶液置于1.5ml一次性离心管底部，加入30μl鸡血清，震荡，轻微涡旋，室温静置平衡3h；
[0039]
(2)依次加入415μl的ph值为7.4的磷酸钾缓冲溶液、12.5μl鸡肝微粒体、以及nadph酶再生体系中的a溶液25μl和b溶液5μl，摇匀，迅速置于37℃水浴振荡反应6h；
[0040]
(3)加入冰冷的500μl乙腈终止反应，在4℃下用10000rpm/min转速离心5min，然后取500μl上清液至进样瓶中，用uplc
‑
esi
‑
hrms测定mccps分子式同系物的含量，结果见表2。表2为氯原子数为7的不同碳链的mccps以及碳原子数为14的不同氯原子数的mccps的代谢清除率，其中底物浓度指步骤(2)中最终反应体系中mccps的浓度。
[0041]
表2
[0042][0043]
表2的结果显示，相同浓度mccps条件下，鸡肝微粒体对相同氯原子的不同碳链的mccps的代谢清除率大小顺序为：c
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>c
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>c
16
>c
17
；鸡肝微粒体对相同碳原子数的不同氯原子数的mccps的代谢清除率大小顺序为：cl5>cl6>cl7>cl8>cl9；对于相同碳原子数和氯原子数的mccps，其代谢清除率随着底物浓度的增加而降低。
[0044]
实施例3
[0045]
鸡肝微粒体离体代谢中链氯化石蜡(lccps)
[0046]
(1)取25μl的lccps乙腈溶液置于1.5ml一次性离心管底部，加入25μl鸡血清，震荡，轻微涡旋，4℃下静置平衡6h；
[0047]
(2)依次加入510μl的ph值为7.4的磷酸钾缓冲溶液、12.5μl鸡肝微粒体、以及nadph酶再生体系中的a溶液25μl和b溶液5μl，摇匀，迅速置于37℃水浴振荡反应2h；
[0048]
(3)加入冰冷的600μl乙腈终止反应，在4℃下用10000rpm/min转速离心5min，然后取500μl上清液至进样瓶中，用uplc
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esi
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hrms测定lccps分子式同系物的含量，结果见表3。表3为氯原子数为7的不同碳链的lccps以及碳原子数为18的不同氯原子数的lccps的代谢清除率，其中底物浓度指步骤(2)中最终反应体系中lccps的浓度。
[0049]
表3
[0050][0051]
表3的结果显示，相同浓度lccps条件下，鸡肝微粒体对相同氯原子的不同碳链的lccps的代谢清除率大小顺序为：c
18
>c
19
>c
20
；鸡肝微粒体对相同碳原子数的不同氯原子数的lccps的代谢清除率大小顺序为：cl5>cl6>cl7>cl8>cl9；对于相同碳原子数和氯原子数的lccps，其代谢清除率随着底物浓度的增加而降低。
[0052]
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对
以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。