一种Ag-CD@GO三元纳米模拟酶及其制备方法与应用与流程

一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及重金属检测技术领域，尤其涉及一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.重金属污染严重破坏生态环境，威胁着人类的健康，已成为世界经济和社会可持续发展的重大障碍。其中，汞是毒性和污染性最大的重金属污染物之一，在自然环境下无法降解或生物转变，容易在生物体内聚集，且具有很强的亲硫性能(如
‑
sh基团)，从而使生物蛋白或生物酶变性、失活。开拓一种高效便捷的重金属汞离子鉴别方法，对有效消除其污染具有重要的理论和实际意义。
4.纳米模拟酶作为一种高效的仿生催化剂，具有稳定性好、能够在温和的条件下催化比色底物的氧化显色反应，可以使比色信号放大的特点，而且具有较高的选择性，已广泛应用于仿生催化和环境分析传感等领域。
5.然而，本发明人发现，现有的纳米模拟酶仍然存在以下方面的问题：(1)常规报道的纳米酶多为金属氧化物、硫化物或贵金属纳米颗粒等，易团聚，稳定性低；(2)其本身具有较强的生物毒性，而且生物兼容性差；(3)一般不溶于水，水溶性低，限制了实际应用范围；(4)比表面积有待进一步提高，催化活性不强等不足。


技术实现要素：

6.针对上述的问题，本发明提供一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶及其制备方法与应用，本发明引入了生物兼容性好、水溶性高、比表面积大的空穴型环糊精及二维氧化石墨烯活性材料，优化制备出稳定性高、水溶性好、比表面积大、仿酶催化性能更好的多孔ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶，并探索其。该纳米模拟酶应用在环境污染检测上时具有催化活性高，比色识别重金属汞离子(hg
2
)灵敏度高的特点，能够高效实现超痕量汞离子的裸眼检测。
7.具体地，为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：
8.在本发明的第一方面，公开一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶，包括纳米银颗粒(agnps)、环糊精(cd)、氧化石墨烯(go)，其中：所述纳米银通过其缺电子空d轨道与环糊精表面氧原子上孤对电子的强配位或静电作用吸附在环糊精表面，所述氧化石墨烯上的富氧基团与环糊精羟基通过强氢键作用自组装形成分布均匀的三元纳米模拟酶ag
‑
cd@go，所述三元纳米模拟酶ag
‑
cd@go为多孔颗粒状结构。多孔状的构造可赋予纳米模拟酶更大的表面积和表面能，可增加与反应底物接触几率，降低反应活化能，从而提高纳米模拟酶的活性
9.进一步地，所述纳米银通过ag
‑
o键、静电吸引作用等中至少一种组装在环糊精上。本发明借助纳米银的亲氧、缺电子特性将纳米银组装在环糊精上，形成更加稳定的纳米模
拟酶。
10.在本发明的一些优选实施方式中，所述三元纳米模拟酶中的环糊精包括α
‑
环糊精、β
‑
环糊精、γ
‑
环糊精等中的至少一种。
11.在本发明的一些实施方式中，所述纳米模拟酶的粒径在200～300nm。这种纳米模拟酶粒径均匀，分散性好，稳定性好。
12.在本发明的第二方面，公开一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶的制备方法，包括步骤：
13.(1)提供含有环糊精、ag

的缓冲液。
14.(2)在该缓冲液中加入还原剂，使ag

还原成纳米银并结合在环糊精表面，得产物ag
‑
cd。
15.(3)将所述ag
‑
cd与氧化石墨烯在水溶液中通过静电作用和/或氢键组装，得到ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶。
16.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，将环糊精加水溶解后再加入缓冲溶液，搅拌均匀，得到含有环糊精、ag

的缓冲液；可选地，所述环糊精包括α
‑
环糊精、β
‑
环糊精、γ
‑
环糊精等中的至少一种。
17.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述缓冲液为混合磷酸盐缓冲液，即磷酸钠，磷酸二氢钠和磷酸一氢钠的混合液，可选地，所述磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠的混合摩尔比为0～2.5：0.5～4：0～1.5。在本发明中，所述缓冲液的主要作用是提高纳米模拟酶的催化活性。
18.在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述ag

以水溶性银盐的形式加入，例如硝酸银、醋酸银、氟化银、氯酸银、高氯酸银等可溶性银盐。在h2o2存在下，所制备的ag
‑
cd@go能够在室温催化氧化比色底物3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)生成蓝色oxtmb，ag
‑
cd@go
‑
tmb对hg
2
具有较强的可视性比色识别能力，并伴有明显深蓝色
‑
浅蓝
‑
无色的可视性变化。
19.在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述还原剂包括：nabh4、lialh4、水合肼、维生素c中的至少一种，通过还原剂的作用ag

被还原成纳米银，并通过纳米银的亲氧、缺电子特性将纳米银组装在环糊精上。
20.在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中，所述环糊精、ag

、氧化石墨烯的摩尔比为0.5～2：0.01～0.1：0.1～1。在本发明中，多羟基的环糊精和多羟基或多氧的氧化石墨烯相互间能够通过极强的静电作用或氢键作用实现自组装。
21.在本发明的第三方面，公开所述ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶在环境水、食品检测等领域中的应用，如自来水、地下水、河水、果汁、可乐、酒等样品中重金属hg
2
的检测。
22.本发明制备的ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶的检测原理为：在h2o2存在下，ag
‑
cd@go能够在室温催化氧化tmb生成蓝色oxtmb，其特征吸收峰位为653nm；当具有较强氧化电势的hg
2
加入时，hg
2
被还原成汞单质，进一步在纳米银表面形成银汞齐，同时蓝色oxtmb将会被可逆的还原为无色tmb，653nm处特征吸收强度逐渐降低，并伴有可视性“蓝色
‑
浅蓝
‑
无色”变化(即减色效应)，因此，ag
‑
cd@go
‑
tmb体系能够在不需借助其他观察仪器的情况下，即可进行检测样品中精细微量元素的快速高效裸眼检测。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.(1)本发明借助纳米银的亲氧、亲氮特性以及多羟基的环糊精和多羟基或多氧的氧化石墨烯相互间极强的静电作用或氢键作用充分组装，得到了具有极强仿过氧化酶活性
的ag
‑
cd@go纳米模拟酶，能够在室温催化氧化tmb生成蓝色oxtmb，ag
‑
cd@go
‑
tmb对hg
2
具有较强的可视性比色识别能力，并伴有明显深蓝色
‑
浅蓝
‑
无色的可视性变化，具有检测限低(达3.3nm，远低于who规定的3.0
×
10
‑8mol
·
l
‑1饮用水汞离子健康标准)、样品中hg
2
回收率高(达92.5～111.0％)、相对误差(rsd小于3.1％)、线性范围宽(0～120
×
10
–8mc
hg2
)、灵敏度高、绿色环保的特点，实现了对环境水及商用果汁饮料样品中超痕量hg
2
的高效检测。
25.(2)由于纳米银的亲氧、亲氮特性以及多羟基的环糊精和多羟基或多氧的氧化石墨烯相互间极强的静电作用或氢键作用，还原生成的纳米银首先通过其缺电子空d轨道与环糊精表面氧原子上孤对电子的强配位或静电作用吸附在环糊精表面，生成二元ag
‑
cd，进一步通过氧化石墨烯富氧基团与环糊精的羟基间强氢键作用自组装形成分布均匀的多孔三组分ag
‑
cd@go。环糊精和石墨烯的引入使本发明制备的这种纳米模拟酶具有无毒无污染，同时分散性好，稳定性高，水溶性好、比表面积大、活性位点多、可增加与反应底物接触几率，降低反应活化能，从而在待检测样品中可以均匀的分散在样品溶液中，与更多的被分析物质充分接触、反应位点大大增加，催化效率更高。
26.(3)本发明的ag
‑
cd@go纳米模拟酶能够在室温催化氧化tmb生成蓝色oxtmb，其特征吸收峰位为653nm；ag
‑
cd@go
‑
tmb对hg
2
具有较强的可视性比色识别能力，653nm处特征吸收强度逐渐降低，并伴有可视性“蓝色
‑
浅蓝
‑
无色”变化，从而目标ag
‑
cd@go
‑
tmb体系能够在不需借助其他观察仪器的情况下，即可进行检测样品中精细微量元素的快速高效裸眼检测。同时，检测样品中常见的共存离子(如ag

、ba
2
、bi
3
、ca
2
、co
2
、cr
3
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、k

、mn
2
、ni
2
、pb
2
、zn
2
等)对比色检测hg
2
无明显干扰，说明本发明的这种ag
‑
cd@go纳米模拟酶具有良好的抗干扰性，表现出了对hg
2
优异的选择性。
附图说明
27.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
28.图1为第一实施例制备的ag
‑
cd@go的tem图。
29.图2为第一实施例制备的ag
‑
cd@go的eds图，其中插图为hr
‑
tem。
30.图3为第一实施例制备的ag
‑
cd@go及其对应组分的xrd图谱对比。
31.图4为第一实施例制备的ag
‑
cd@go及不同组分过氧化模拟酶活性对比，其中插图为各模拟酶的颜色变化。
32.图5中a～e依次为陈化时间、ph、tmb浓度、h2o2浓度、温度对第一实施例制备的ag
‑
cd@go活性的影响。
33.图6为第一实施例制备的ag
‑
cd@go随h2o2、tmb浓度变化的动力学曲线，其中，a图为固定h2o2浓度40mm、改变tmb的浓度的动力学曲线，b图为固定tmb的浓度0.04mm、改变h2o2浓度的动力学曲线。
34.图7为第一实施例制备的ag
‑
cd@go随h2o2、tmb浓度变化的双倒数曲线图，其中，a图为tmb浓度变化的双倒数曲线图，b图为h2o2浓度变化的双倒数曲线图。
35.图8为不同的干扰离子对第一实施例制备的ag
‑
cd@go的光谱性能的影响，其中，从上到下曲线依次为ag

、ba
2
、bi
3
、ca
2
、co
2
、cr
3
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、k

、mn
2
、ni
2
、pb
2
、zn
2
，插
图为比色性能图。
36.图9为干扰离子与hg
2
共存时，对第一实施例制备的ag
‑
cd@go光谱性能的影响图。
37.图10为比色传感重金属hg
2
的光谱滴定曲线，其中：从上到下曲线代表的依次为hg
2
浓度依次为：0、0.4、0.8、1.6、2.4、4.0、6.0、10.0、15.0、20.0、38.0、64.0、80.0、100.0、120.0
×
10
‑8m，插图为颜色变化图片。
38.图11为第一实施例制备的ag
‑
cd@go的吸光强度(a
653
)和汞离子的浓度(c
hg2
)间的线性关系。
39.图12为可视性比色识别hg
2
完成后第一实施例制备的ag
‑
cd@go的eds图，其中插图为hr
‑
tem。
具体实施方式
40.在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
41.除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
42.第一实施例
43.一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶的制备方法，包括步骤：
44.(1)称取0.0113g(0.01mmol)β
‑
环糊精置于50ml圆底烧瓶中，加10ml水溶解，然后向其中加入5ml ph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钠38.5g，与磷酸氢二钠5.00g，加水定容成1000ml配成，即磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的摩尔比为9.1:1)，搅拌均匀得到含有β
‑
环糊精的缓冲液。
45.(2)在步骤(1)得到的含有β
‑
环糊精的缓冲液中加入1ml 0.1mm的agno3溶液，在常温下搅拌2h后加入1ml 0.01m的nabh4，常温搅拌反应2h，将ag 还原成纳米银颗粒(ag nps)并结合在β
‑
环糊精表面，得含有ag
‑
cd的反应液。
46.(3)将步骤(2)得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物ag
‑
cd水洗3次，得到纯净ag
‑
cd。
47.(4)将步骤(3)得到的纯净ag
‑
cd溶解到10ml水中，再加入1ml 2mm氧化石墨烯(go)，常温搅拌12h，使氧化石墨烯和ag
‑
cd中的环糊精通过强静电作用或氢键充分组装。完成后将得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物水洗3次，制得多孔银
‑
环糊精
‑
氧化石墨烯三元纳米模拟酶(ag
‑
cd@go)。
48.第二实施例
49.一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶的制备方法，包括步骤：
50.(1)称取0.05mmolα
‑
环糊精置于50ml圆底烧瓶中，加15ml水溶解，然后向其中加入10ml ph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(磷酸钠、磷酸一氢钠和磷酸二氢钠按照1：0.5：1.5的摩尔比加入1000ml水中混合而成)，搅拌均匀得到含有α
‑
环糊精的缓冲液，备用。
51.(2)在步骤(1)得到的含有α
‑
环糊精的缓冲液中加入50ml 0.1mm的agf溶液，在常
温下搅拌3h后加入10ml 0.01m的水合肼，常温搅拌反应2.5h，将ag

还原成纳米银颗粒(ag nps)并结合在环糊精表面，得含有ag
‑
cd的反应液。
52.(3)将步骤(2)得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物ag
‑
cd水洗3次，得到纯净ag
‑
cd。
53.(4)将步骤(3)得到的纯净ag
‑
cd溶解到10ml水中，再加入50ml2mm氧化石墨烯(go)，常温搅拌12h，使氧化石墨烯和ag
‑
cd中的环糊精通过强静电作用或氢键充分组装。完成后将得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物水洗3次，制得多孔银
‑
环糊精
‑
氧化石墨烯三元纳米模拟酶(ag
‑
cd@go)。
54.第三实施例
55.一种ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶的制备方法，包括步骤：
56.(1)称取0.2mmolγ
‑
环糊精置于50ml圆底烧瓶中，加60ml水溶解，然后向其中加入40ml ph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液(磷酸钠、磷酸一氢钠按照2.5：4的摩尔比加入1000ml水中混合而成)，搅拌均匀得到含有γ
‑
环糊精的缓冲液，备用。
57.(2)在步骤(1)得到的含有γ
‑
环糊精的缓冲液中加入100ml 0.1mm醋酸银溶液，在常温下搅拌3h后加入100ml 0.01m的lialh4，常温搅拌反应3h，将ag 还原成纳米银颗粒(ag nps)并结合在环糊精表面，得含有ag
‑
cd的反应液。
58.(3)将步骤(2)得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物ag
‑
cd水洗3次，得到纯净ag
‑
cd。
59.(4)将步骤(3)得到的纯净ag
‑
cd溶解到10ml水中，再加入50ml2mm氧化石墨烯(go)，常温搅拌12h，使氧化石墨烯和ag
‑
cd中的环糊精通过强静电作用或氢键充分组装。完成后将得到的反应液置于离心机中，并在7000r/min的转速下离心，将得到的固体产物水洗3次，制得多孔银
‑
环糊精
‑
氧化石墨烯三元纳米模拟酶(ag
‑
cd@go)。
60.性能表征、测试：
61.1、采用透射电镜对第一实施例制备的ag
‑
cd@go进行观察，结果如图1至图3所示。其中：图2、图3分别为该ag
‑
cd@go的eds图和xrd图谱，可以看出，第一实施例成功制备出了成分为银、环糊精、氧化石墨的产物。图1为所述ag
‑
cd@go在透射电镜下的微观图，可以看出，制备的ag
‑
cd@go纳米模拟酶成多孔状结构，而且分散均匀，粒径在200～300nm左右，其能够提供更大的表面积，更多的活性位点，提高对重金属离子汞的检测能力。这是由于本发明利用了纳米银的亲氧、缺电子特性以及多羟基的环糊精和多羟基或多氧的氧化石墨烯相互间极强的静电作用或氢键作用，使纳米银、氧化石墨烯牢固地组装在环糊精上，形成更加稳定的纳米模拟酶。
62.2、测试第一实施例的ag
‑
cd@go对重金属离子的检测能力，包括：
63.(1)配制0.1mg/mlag
‑
cd@go标准溶液：
64.称取0.01g干燥的ag
‑
cd@go，超声条件下分散到100ml纯净水中，配制出浓度为0.1mg/ml的ag
‑
cd@go标准溶液，在室温下保存、备用。
65.(2)配制hg
2
标准溶液：
66.在100ml容量瓶中加入0.0027ghgcl2，待完全溶解后，用水定容到100ml，配制出浓度为1.0
×
10
‑4mol/l的hgcl2标准溶液，在室温下保存、备用；使用时，进一步用水稀释到所需的浓度。
67.(3)待测样品配制：
68.随机量取500ml环境水及商用果汁饮料样品，包括：公寓自来水、地下水、蓼河水、果汁、可乐、酒各1份，经4μm的微孔过滤膜过滤三次，氮吹浓缩至5.0ml，放置在冰箱中(4℃)保存，备用。
69.(4)ag
‑
cd@go纳米模拟酶活性测试：
70.向5ml容量瓶中依次加入400μl上述的ag
‑
cd@go标准溶液，200μlph＝4.0的磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲溶液，180μl浓度为1.5mm的比色底物3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)和180μl浓度为1.0m的h2o2，纯净水定容并混合均匀，室温下陈放20min，测量体系在300～800nm范围内的吸收光谱，并观察溶液颜色的变化。并在相同条件下对比了agnps
‑
cd及go在有、无h2o2条件下的光谱及溶剂颜色的变化，结果如图4所示，可以看出，只有在h2o2存在下，ag
‑
cd@go能够在室温催化氧化tmb生成蓝色oxtmb，并在653nm处出现最强的特征吸收峰，这说明ag
‑
cd@go具有极强的仿过氧化酶活性，生成在653nm蓝光区有强吸收的蓝色oxtmb，增强了ag
‑
cd@go模拟酶分析应用的可视性和光谱活性。
71.3、本试验研究了ph、温度、tmb浓度、h2o2浓度以及陈化时间对ag
‑
cd@go纳米过氧化模拟酶活性的影响，结果如图5所示，确定最佳模拟酶活性条件为：ag
‑
cd@go用量为400μl(0.1mg/ml)、ph＝4.0、温度25℃、tmb浓度为1.5mm、h2o2浓度为1.0m、陈化时间为室温20min。因此，重金属离子的检测更宜在该条件下进行。
72.图6、图7分别为第一实施例制备的ag
‑
cd@go随h2o2、tmb浓度变化的动力学曲线、双倒数曲线图，可以看出，模拟酶催化tmb和h2o2的米氏常数(k
m
)分别为3.3mm和0.13mm，最大起始速率(v
max
)分别为2.45
×
10
‑8m
·
s
‑1和2.52
×
10
‑8m
·
s
‑1，这意味着制备的ag
‑
cd@go三元纳米模拟酶具有较强的仿酶催化活性和催化速率，能过较快的催化tmb、h2o2等底物反应至完全。
73.4、ag
‑
cd@go纳米模拟酶对hg
2
的检测：
74.(1)图8和图9研究了常见环境金属离子对ag
‑
cd@go纳米模拟酶活性选择性，从图中可以看出，检测样品中常见的共存离子：ag

、ba
2
、bi
3
、ca
2
、co
2
、cr
3
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、k

、mn
2
、ni
2
、pb
2
、zn
2
等对比色检测hg
2
无明显干扰，ag
‑
cd@go
‑
tmb体系对hg
2
具有专一的选择性比色响应，并伴有可视性“蓝色
‑
浅蓝
‑
无色”变化，从而使ag
‑
cd@go纳米模拟酶能够在不需借助其他观察仪器的情况下，即可进行检测样品中精细微量元素的快速高效裸眼检测。
75.(2)在上述最佳模拟酶活性条件下以及常见环境金属离子对ag
‑
cd@go模拟酶活性选择性的基础上，取400μl(0.1mg/ml)ag
‑
cd@go标准溶液于5ml容量瓶中，加入200μlph＝4.0的磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲溶液、180μl(1.5mm)tmb、180μl(1.0m)h2o2和100μl待测样品，再用纯净水定容到5ml，混合均匀，室温下陈放20min，测量300～800nm范围内的uv
‑
vis吸收光谱，并找出a
653
对c
hg2
的线性比率关系，结果如图10和图11所示。从图中可以看出：在0.4～20
×
10
–8m范围内，线性回归方程为a
653
＝0.44376
–
0.01505c
hg2
(r2＝0.9421)；在20～120
×
10
–8m范围内，线性回归方程为a
653
＝0.2228
–
0.0011c
hg2
(r2＝0.9911)，检测限低达3.3nm(s/n＝3)，远低于国际卫生组织规定的3.0
×
10
‑8mol
·
l
‑1饮用水汞离子健康标准。
76.(3)在线性范围为0～120.0
×
10
‑8m c
hg2
内，依据所得到的上述线性回归方程，成功应用于公寓自来水、地下水、蓼河水、果汁、可乐、酒等环境水及商用果汁饮料样品中汞离
子裸眼的检测，结果见表1。
77.表1环境水及商用果汁饮料样品中hg
2
的检测结果(n＝5)
a
[0078][0079]
a c
ag
‑
cd@go
＝0.1mg/ml,ph＝4.0
[0080]
从表1的测试结果可以看出，样品中hg
2
回收率92.5％～111.0％之间，相对误差(rsd)小于3.1％，这说明上所述ag
‑
cd@go纳米模拟酶应用于环境水及商用果汁饮料样品(公寓自来水、地下水、蓼河水、果汁、可乐、酒等)痕量重金属hg
2
比色检测时，具有快速，选择性好，灵敏度高等特点，能够有效对环境水及商用果汁饮料样品中超痕量hg
2
进行高效检测。
[0081]
ag
‑
cd@go纳米模拟酶可视性比色识别重金属汞元素的作用机理如图12所示，检测完成后，材料的元素分析中出现了重金属汞元素，且晶格距离从识别前0.229nm(纳米银的晶格，图2插图)增加到0.256nm(银汞齐的晶格，图12插图)。
[0082]
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的根据权利要求为准。