一种上转换纳米复合材料及其制备方法和在检测原花青素中的应用与流程

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种上转换纳米复合材料及其制备方法和在检测原花青素中的应用。

背景技术：

原花青素广泛存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中。因其多种生理活性，如抗肿瘤、抗衰老、抑制脂质过氧化和血小板凝集和保护视力等，因此准确测定原花青素在植物体内的分布及含量尤为重要。传统的检测原花青素的方法有很多，包括紫外-可见分光光度法，高效液相色谱法，质谱法以及核磁共振等。然而，每种方法都有其自身的局限性，限制了这些方法在实践中的应用。

鉴于上述情况，开发一种操作简单、具有好的选择性及高的灵敏度的分析方法尤为重要。荧光分析法是指物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回到基态时，过剩的能量以电离辐射的形式(发光)释放出来，其荧光发射光谱可用作该物质的定性或定量分析。荧光光谱分析方法具有灵敏度高、选择性强、设备简单等优点，被广泛运用于环境分析，生物样品检测，细胞、组织、活体成像等领域。荧光内滤效应是在非共价偶联荧光传感体系中，因荧光体的发射光谱与吸收体的吸收光谱有相当程度的重叠，而导致荧光体的光吸收信号转变为更为灵敏的荧光信号，从而提高检测方法的灵敏度。由于荧光内滤效应过程不依赖于荧光体和吸收体之间的距离，因此更加简单灵活，在分析检测中被广泛应用。

上转换纳米材料是一种可以将长波长光(通常是700-1700nm)转换成短波长光(通常350-700nm)(将低能光转化为高能光)的材料。由于激发光在能量较低的红外光区，对生物组织的损伤较小，同时由于生物样品对该红外光的吸收很小，可以有效地避免生物样品自身的荧光干扰。故在给定信号的情况下，与其它传统的光学方法相比较，该法无背景干扰，且灵敏度高，故使其在生物传感方面应用广泛。目前，利用光学方法检测原花青素还未报道。

技术实现要素：

本发明为解决上述现有技术中存在的问题，采用的技术方案是提供一种上转换纳米复合材料，该复合材料微观为具有核壳结构的纳米粒子，具体为在yb和tm共掺杂的nayf4内核外面包覆有yb掺杂的nayf4壳层，nayf4:yb壳层表面连接有cit-cd，记为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd。

进一步的，本发明复合材料微观为单分散的规则六边形纳米粒子；直径约为40-50nm，相邻晶格条纹间距为0.40-0.58nm；c、y、yb和tm元素均匀分布在y/yb/tm@y/yb-cit-cd纳米粒子上。

进一步的，本发明复合材料荧光光谱的激发波长和最佳发射波长分别为980nm和482nm。

本发明进一步公开了上述上转换纳米复合材料的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)nayf4:yb/tm纳米粒子的合成；nayf4:yb/tm纳米粒子指的是nayf4的yb、tm共掺杂物，通常是指以nayf4作为基质材料，以yb作为活化剂、tm作为激活离子对nayf4进行掺杂所得。

(2)在nayf4:yb/tm纳米粒子外包覆nayf4:yb制得具有核壳结构的纳米粒子，记为nayf4:yb/tm@nayf4:yb；nayf4:yb指的是nayf4的yb掺杂物。

(3)cit-cd复合物的制备；

(4)nayf4:yb/tm@nayf4:yb纳米粒子转水去油酸；

(5)在步骤4所得纳米粒子表面修饰cit-cd复合物制得nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd纳米粒子。

具体的，步骤1具体为将ycl3、ybcl3、tmcl3加入三口烧瓶，蒸干水，然后往烧瓶中加油酸和十八烯，n2保护下，加热烧瓶直到烧瓶中干掉的氯化物溶解，液体变澄清透明，接着将该透明溶液冷却到室温，将溶解有naoh和nh4f的甲醇溶液滴加进烧瓶，常温搅拌，随后加热烧瓶中的混合液蒸发甲醇，蒸完甲醇后，接着在n2保护下将混合液加热反应，反应结束后，冷却溶液到室温，用乙醇沉淀出纳米晶。

具体的，步骤2具体为将ycl3，ybcl3加入三口烧瓶，蒸干水，然后往烧瓶中加油酸和十八烯，n2保护下，加热烧瓶直到烧瓶中的干掉的氯化物溶解，液体变澄清透明，接着将该透明溶液冷却到室温，接着取步骤1所得nayf4:yb/tm纳米粒子的环己烷分散液加入烧瓶，室温搅拌，随后加热烧瓶中的混合液蒸发环己烷，蒸完环己烷后，将温度降到室温，将溶解有naoh和nh4f的甲醇溶液滴加进烧瓶，常温搅拌，随后加热烧瓶中的混合液蒸发甲醇，蒸完甲醇后，接着在n2保护下将混合液加热反应，反应结束后，冷却溶液到室温，用乙醇沉淀出纳米晶，然后用环己烷洗一遍，备用。

具体的，步骤3具体为β-环糊精加入溶有柠檬酸的水中，油浴下反应，得到的产物真空烘干，烘干后的产品用索氏提取器在异丙醇中回流洗涤，将洗涤后的产物烘箱中真空干燥，备用。

具体的，步骤4具体为取适量步骤2所得油酸包覆的nayf4:yb/tm@nayf4:yb纳米粒子加入去离子水中，然后用0.1m的hcl水溶液调节分散液的ph值至3-4，常温搅拌，然后用乙醇沉淀收集，收集物重新分散进去离子水中。

具体的，步骤5具体为往步骤4收集物的水分散液中加入碳二亚胺水溶液，常温搅拌，接着往上述溶液中加入n-羟基丁二酰亚胺水溶液，避光下，室温搅拌，接着将cit-cd加入上述溶液，继续搅拌，最后溶液储存在4℃下备用。

本发明还公开了上转换纳米复合材料在在检测原花青素中的应用，包括如下步骤：

(1)以甲醇为溶剂，分别配制浓度梯度为0.1、50、100、200、400、600、800、1000μm的原花青素标准溶液；

(2)然后将不同浓度的原花青素标准溶液与浓度为1mg/ml的上转换纳米材料溶液混合均匀，使用980nm作为激发波长，随着原花青素浓度的增加，记录482nm处的荧光发射峰，以原花青素浓度作为横坐标，荧光强度作为纵坐标进行线性拟合，得到线性方程，建立原花青素检测的标准曲线；

(3)配制样品溶液，检测482nm处的荧光强度，并结合标准曲线拟合出的线性方程，计算出样品中的原花青素浓度。

本发明所产生的有益效果为：

(1)本发明提供的上转换复合纳米材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd具有稳定光学性能和良好的水溶性；

(2)本发明提供的上转换复合纳米材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd荧光发射峰位置在482nm处；

(3)本发明提供的上转换复合纳米材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd可基于荧光内滤效应检测原花青素；

(4)本发明提供的上转换复合纳米材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd能够用于植物细胞内原花青素的检测；

(5)本发明提供的上转换复合纳米材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd检测原花青素的方法与传统检测方法相比，不需要昂贵的仪器和专业培训的人员来进行操作即可检测，同时具有省时省力，具有检测限低，准确性好，简单快速检测的优点。

附图说明

图1为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的tem图；

图2为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的hrtem图；

图3为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的元素映射图；

图4为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的x射线衍射图；

图5为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的荧光发射光谱和原花青素的紫外吸收光谱图；

图6为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd检测不同浓度原花青素的荧光发射光谱图；

图7为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd检测原花青素的线性关系图；

图8为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd检测原花青素选择性柱状图；

图9(a)为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd处理白洋葱组织后的激光扫描共聚焦成像，(b)为nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd 原花青素处理白洋葱组织后的激光扫描共聚焦成像。

具体实施方式

本发明用到的材料和试剂如下：

ycl3，ybcl3，tmcl3，n-羟基琥珀酰亚胺和n-(3-二甲基氨基丙基-n-乙基碳二亚胺盐酸盐)购自北京hwrkchemco.，ltd。(中国)，柠檬酸一水合物(试剂级，≥99.5％)，十八碳烯(工业级90％)，油酸(工业级90％)购自aldrich；原花青素购自上海元业生物技术有限公司；naoh(试剂级≥96％)和氟化铵(nh4f)，试剂级，≥99.5％)，甲醇(试剂级，≥99.5％)，环己烷(试剂级，≥99.7％)，异丙醇(试剂级，≥99.5％)购自xilongscientific。

实施例1

上转换纳米复合材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd的制备

(1)nayf4:yb/tm纳米粒子的合成：将ycl3(0.80mmol)，ybcl3(0.20mmol)，tmcl3(0.02mmol)加入三口烧瓶，90℃蒸干水，然后往烧瓶中加油酸(oa；6ml)和十八烯(ode；15ml)，n2保护下，加热烧瓶到130℃，直到烧瓶中的干掉的氯化物溶解，液体变澄清透明，接着将该透明溶液冷却到室温。将溶解有naoh(2.5mmol)和nh4f(4mmol)的10ml甲醇溶液滴加进烧瓶，常温搅拌10min；随后加热烧瓶中的混合液到70℃蒸发甲醇，蒸完甲醇后，在110℃下抽真空30min，接着在n2保护下将混合液加热到300℃，保持这个反应温度60min，反应结束后，冷却溶液到室温，用乙醇沉淀出纳米晶，然后用环己烷洗一遍，最后分散进8ml环己烷中，备用；

(2)nayf4:yb/tm@nayf4:yb纳米粒子的合成：将ycl3(0.80mmol)，ybcl3(0.20mmol)加入三口烧瓶，90℃蒸干水，然后往烧瓶中加油酸(oa；6ml)和十八烯(ode；15ml)，n2保护下，加热烧瓶到130℃，直到烧瓶中的干掉的氯化物溶解，液体变澄清透明，接着将该透明溶液冷却到室温。接着取上述nayf4:yb/tm纳米粒子的环己烷分散液加入烧瓶，室温搅拌10min，随后加热烧瓶中的混合液到70℃蒸发环己烷，蒸完环己烷后，将温度降到室温，将溶解有naoh(2.5mmol)和nh4f(4mmol)的10ml甲醇溶液滴加进烧瓶，常温搅拌10min；随后加热烧瓶中的混合液到70℃蒸发甲醇，蒸完甲醇后，在110℃下抽真空30min，接着在n2保护下将混合液加热到300℃，保持这个反应温度60min，反应结束后，冷却溶液到室温，用乙醇沉淀出纳米晶，然后用环己烷洗一遍，备用；

(3)cit-cd复合物的制备：3.0gβ-环糊精(cd)加入溶有1.02g柠檬酸(cit)的1.8ml水中，油浴105℃下反应3h，得到的产物60℃真空烘干，烘干后的产品用索氏提取器在异丙醇中回流洗涤6h。将洗涤后的产物于60℃烘箱中真空干燥，备用；

(4)油酸包覆的nayf4:yb/tm@nayf4:yb纳米粒子转水去油酸：取油酸包覆的nayf4:yb/tm@nayf4:yb纳米粒子60mg，加入60ml去离子水中，然后用0.1m的hcl水溶液调节分散液的ph值至3.2，常温搅拌12h，然后用乙醇沉淀收集，收集物重新分散进60ml去离子水中；

(5)nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd复合体系的制备：往上述60ml收集物的水分散液中加入10μl1.0mmol/l的碳二亚胺(edc)水溶液，常温搅拌20min，接着往上述溶液中加入20μl0.5mmol/l的n-羟基丁二酰亚胺(nhs)水溶液，避光下，室温搅拌2h。接着将2ml的cit-cd(1.0mg/ml)加入上述溶液，继续搅拌12h，最后溶液储存在4℃下备用。

将实施例1制备的纳米复合材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd进行tem、hrtem、元素映射和xrd表征，分别如图1、图2、图3、图4所示，结果表明，所制备的nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd生长均匀，为单分散的规则六边形，直径约为46nm，相邻晶格条纹间距为0.48nm。从元素映射图可以看出，c、y、yb和tm元素均匀分布在y/yb/tm@y/yb-cit-cd纳米粒子上，此外，在纳米颗粒区域c的浓度较大，这证明cit-cd成功的连接在了y/yb/tm@y/yb纳米粒子的表面。从x射线衍射图谱可以看出，y/yb/tm@y/yb纳米粒子的所有衍射峰都可以和六方相的β-nayf4的jcpds16-0334号标准卡匹配良好。

扫描本实施例制备的纳米复合材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd在980nm激发下的荧光发射光谱以及原花青素的紫外吸收光谱如图5所示，结果表明本实施例合成的上转换纳米材料其荧光发射峰在482nm处，这与原花青素的紫外吸收光谱具有有效的重叠，使得荧光内滤效应发生，因此，利用体系中光信号的改变来实现对原花青素的检测。

实施例2

将实施例1制备的纳米复合材料nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd用于原花青素的检测并建立原花青素检测的标准曲线，步骤为：

(1)以甲醇为溶剂，分别配制浓度梯度为0.1、50、100、200、400、600、800、1000μm的原花青素标准溶液；

(2)然后将不同浓度的原花青素标准溶液与浓度为1mg/ml的上转换纳米材料溶液按体积比1:1混合均匀，使用980nm作为激发波长，随着原花青素浓度的增加，记录482nm处的荧光发射峰，如图6所示，以原花青素浓度作为横坐标，以荧光强度作为纵坐标进行线性拟合，得到线性方程，建立原花青素检测的标准曲线，如图7所示。

实施例3

为了评估本发明提供的检测原花青素方法的实用性，对实际食品样品中原花青素含量进行了测定。本实施例在各参数最优条件下，检测了水果、药用植物、蔬菜、果酒和茶叶中原花青素的浓度。具体的，取样品(10-100)mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入30ml甲醇，超声处理20min，放置室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或放置澄清后取上清液作为供试品溶液，采用本发明提供的检测原花青素的方法，扫描荧光光谱，根据检测出的482nm处的荧光强度，并结合实施例2中的标准曲线拟合出的线性方程，计算出实际样品中的原花青素浓度，检测结果如表1所示。根据表1结果，可以看出本发明提供的检测原花青素的方法与天津地方标准db12/t885-2019检测结果一致，两种方法的相对误差小于7％，由此说明本发明本发明实施例提供的方法能有效应用于实际食品中的原花青素的检测。

表1不同样品中原花青素的测定结果

实施例4

为了评估本发明提供的检测原花青素方法的选择性，分别配制1mm浓度的各类药用成分和离子溶液，包括原花青素、欧前胡素、芦丁、槲皮苷、大黄素、羟基茜草素、氯化钙、氯化钾、氯化镁、氯化铁、氯化铜、氯化铝、氯化铬、氯化氨、氯化钠、碳酸氢钠、钼酸钠、硝酸锌、硫酸锰。向荧光比色皿中添加等体积的nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd和上述溶液，在980nm的激发下，记录482nm处的荧光强度，确定nayf4:yb/tm@nayf4:yb-cit-cd对原花青素的选择性，如图8所示，结果表明，与其他药用植物成分和离子溶液相比，本发明提供的上转化纳米复合材料对原花青素有良好的选择性。

实施例5

为了评估本发明提供的检测原花青素方法在检测植物细胞内原花青素的实用性，对白洋葱细胞中原花青素含量进行了分析。

选取植物材料(白洋葱)，将他们切成0.5cm×0.5cm的块状，并将它们在35℃下干燥24h,然后在26℃下和本发明提供的上转化纳米复合纳米粒子(11.25mg/ml，2ml)共孵育2h。实验组加入原花青素(5mg/ml，100μl),对照组加入等量双蒸水。接着，用去离子水冲洗掉洋葱表面的纳米粒子，放入-20℃冰箱备用。最后，利用植物材料样本进行组织切片和上转换荧光成像分析，以荧光强度的猝灭度来反应植物细胞中原花青素的有无及多少。如图9a和图9b所示,洋葱表皮细胞(不含原花青素)的细胞质中能够看见明亮的蓝色光斑，而含原花青素的细胞表现出的蓝色荧光非常弱。因此，植物中的原花青素含量的高低可以通过细胞内荧光强度的高低来间接反应。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。