专利名称：一种通过层析法制备含因子viii的病毒灭活级分的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过层析法制备含因子VIII的一种病毒灭活级分的方法，以及一种可通过按照本发明的方法得到的含因子VIII的级分。
因子VIII是一种在血凝中起重要作用的至关重要物质。血凝疾患因此可通过施用因子VIII治疗。因而，对可施用的因子VIII制剂的需求很大。已作了很多尝试以便从自然来源分离高度富含形式的因子VIII。因此，用于从冷沉淀物提纯因子VIII的层析法已是公知的。冷沉淀物是对血浆进行冷沉淀得的一种成分。EP 367840B1涉及一种从血浆中分离因子VIII而不预先进行冷沉淀的层析法。在经离子交换基团修饰的亲水性材料上经层析分离法分离该含因子VIII的成分。EP 0238701涉及一种用于制备超纯的、易传播的抗血友病因子的方法，其中经预处理的级分是一种用乙醇沉淀法从纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白和其它干扰成分中分离的冷沉淀物。欧洲专利申请88108458.6描述了在冷沉淀物级分的病毒灭活后用离子交换器层析进行分离。EP 0173242A描述了在仅基于碳水化合物的阴离子交换材料上通过层析法取得因子VIII制剂的方法，该碳水化合物基质被DEAE基团修饰。特别地，DEAEsepharose和DEAE纤维素按照用途被描述。在GB-A-1178958中，描述了一种使用ECTEOLA纤维素柱的因子VIII提纯法。该被修饰的纤维素包含由表氯醇和三乙醇胺反应引入的基础物质。上述先有技术应用批量层析或柱层析的形式进行层析分离。虽然用这些方法得到了相当好的结果，为经济的和伦理的原因还希望增加有生物学上价值的因子VIII的产量。
因此，构成本发明基础的技术问题在于提供一种方法，该方法从先有技术出发，能够在使因子VIII的制备在产量和生物活性方面得到提高。
令人惊异地，该问题已得到解决。以冷沉淀物或血液血浆为出发材料，可选择随后进行氢氧化铝处理，将冷沉淀物溶解后使用膜层析法进行分离。
本发明涉及方法的实施可采用商品冷沉淀物或血液血浆。优选地，将解冻的冷沉淀物用氢氧化铝处理，目的是对样品进一步预提纯以便预浓缩因子VIII。
优选地，在实际进行层析纯化之前，对排列在膜内或膜上的材料进行病毒灭活。该病毒的灭活按照在EP 131740A1中描述的方法通过用生物相容的有机溶剂(去垢剂)，Triton×100/TNBP，优选吐温/TNBP(三-n-丁基磷酸盐)处理而进行。采用Natriumcholat/TNBP也得到很好的结果。优选地，去污剂的用量最多达15％重量比。然而，病毒的灭活也可在用膜层析法分离后进行。
为提纯样品中的因子VIII，层析步骤可在经离子交换基团，特别是阴离子交换剂修饰的基础材料上进行，或在经免疫亲和配基修饰的材料上进行。关键的是，所述这些材料都是排列在膜上的优选地，这些膜由基底材料如经修饰的纤维素或塑料纤维制成。特别适用的是膜，和由多孔的多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)和/或其它具有类似结构的多孔亲水聚合物和亲水聚苯乙烯所制成的致密盘。
在第一种情况，适用于分离的膜或者由用纤维素或塑料纤维制成的堆积的薄膜组成，或者在第二种情况下它由用二氧化硅凝胶或多聚物载体制成的致密盘组成。该膜或盘的基底材料提供相应的阴离子交换基团或免疫亲和配基。特别地，阴离子交换基团如季胺或二乙胺乙基基团被当作离子交换基团。阳离子交换剂一般采用弱的和强的酸性阳离子交换剂，例如被磺酸或磷酸基团修饰的材料。
该离子交换基团可结合在基底材料纤维上，带或不带所谓的隔离物。提供隔离物的材料也被称为触须材料(Tentakelmaterial)。在DE 4204694中提到了相应的隔离物和配基。例如，一种糖胺残基也可用作一个隔离物。阴离子交换基团如DEAE或季胺也可结合在由多孔多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)或其它被提及的材料制成的膜上。该阴离子交换基团的结合可直接在形成膜的材料上，也可通过一个隔离物如糖胺残基发生。
在本发明涉及的方法的另一实施方案中，使用了应用具有对因子VIII的高度亲和性的固定物质的亲和膜层析法。特别地，可能采用单克隆和/或多克隆抗体或抗体的因子VIII结合片段(免疫亲合膜层析)。优选该抗体来自人或鼠。
对因子VIII具亲和性的物质借助于化学性质活泼的基团被固定在载体上。优选地，该活泼的基团将攻击隔离物的末端面非直接攻击载体材料。对因子VIII的该物质的固定通过在活泼的基团例如甲苯磺酸，tresyl，酰肼和其它的结合而发生。相应的方法见于T.M.philips“层析法”(E.Heftmann，编)第5版；Elsevier，阿姆斯特丹1992中的“亲和层析法”。
该抗体也可在带有蛋白A或蛋白G配基的膜上被预吸附。通过随后的共价交联，可避免抗体的洗脱(流出柱子)。为在蛋白A或蛋白G膜上交联该抗体可使用与松驰的载体类似的方法。在蛋白A或蛋白G上固定的优点是该抗体仅被固定在分子的恒定片段(Fc)。因此，该抗原结合部分(Fab)保持游离并且其与因子VIII的相互作用未被妨碍。
在另一项优选的实施方案中，疏水相互反应的材料被保证用于分离因子VIII。所使用的疏水材料为开环的和/或环烷基链，例如C1至C18烷基链，和芳香族化合物。提供疏水相互反应的合适物质优选那些具有分级的疏水性者。疏水性可通过引入极性基团，例如质子极性或非质子极性基团，如羟基、胺基、氰基来分级。优选地，根据相应的分离条件选用。
也可通过热处理进行病毒灭活。优选地，含因子VIII的该被洗脱样品经第一次膜层析步骤后进行巴氏消毒步骤。在P 4318435.9中已提出一个相应的步骤。其中，富含因子VIII的级分在稳定剂存在下接触二或三烷基磷酸盐和可任选的湿润剂，并同时或随后在55℃至67℃范围的升高的温度下被处理5小时至30小时。将两种病毒灭活的方法，即用热和去垢剂处理，结合起来可能是有利的。
为了去除在巴氏灭菌步骤中置入的化学物质，可随后进行第二次膜层析。优选地，采用经DEAE或季铵化合物修饰的膜分离添加的稳定剂，DEAE和季胺化合物膜经隔离物排列在层析载体物质表面。另外，有可能将相应配基排列在没有隔离物的载体材料表面。在选择的条件下该稳定剂不被这种阴离子交换材料阻滞，而因子VIII被吸附在该层析材料上。
然后用有梯度上升的盐浓度的水溶剂系统洗脱因子VIII。
这样使用常规的方法，将取得的含因子VIII的级分浓缩，灌装必要时冻干。
优选地采用从具有低离子强度的溶液上样进行第一次膜层析分离步骤中分离得到的因子VIII。优选地，该水性系统具有相当于0至150mM氯化钠溶液的离子强度。在这样的离子强度下，因子VIII仍被吸附在层析材料上，而更弱地结合的杂质在具有相同离子强度的水性系统的洗脱下被洗掉。
本发明相关方法另一实施方案中，可使用具有相当于200至400mM氯化钠溶液的离子强度的水性系统进行被吸附的材料的提纯。然后用具有相当于500至1500mM氯化钠溶液的离子强度的水性系统进行因子VIII的解吸和该级分的洗脱，而pH维持在4至9的范围内。如果进行阳离子层析，优选在pH值小于6进行，而阴离子交换层析则宜在6以上的较高pH值下进行。
如果因子VIII的提纯是用免疫亲和膜层析法进行的，则，与使用离子交换材料的上述方法不同，洗脱是用离液剂(chaotropenreagenzien)或高浓度盐溶液进行的。优选地，在足以破坏对因子VIII具高亲和性的物质和因子VIII本身之间结合的离液剂或盐浓度下进行洗脱。在相应洗部系统中所述物质的浓度取决于因子VIII和其相应结合成分间的亲合力的强度。优选地，具有不太高的亲和力的抗体被用作免疫亲和配基。作为结果是，在具有较低变性能力的水性溶液条件下可发生洗脱。优选地，具有1至6M尿素，特别是2至4M尿素浓度的水性溶性，或相应的高浓度的盐溶液被用于从免疫亲和膜上洗脱因子VIII。
在疏水相互反应层析中，样品被加至具有很高离子强度的水性溶液中，如，高浓度的硫酸铵(高至4M的浓度)或氯化钠(高至5M的浓度)。特别地，洗脱是用较低离子强度的盐溶液梯度地或线性地进行。含有有机溶剂的水性溶液，特别是稀释的酒精溶液，也可为具有较低离子强度的溶液用于在疏水交叉反应膜层析中样品的洗脱。
本发明相关的方法令人惊异地保证了一种因子VIII的快速和不复杂的提纯，并同时得到高纯度和高产率。另外，如此得到的因子VIII的比活很高，是因为本发明相关的方法中活性因子的低变性。因此，通过本发明相关的方法能得到的含因子VIII级分是本发明的一个目标。
权利要求
1.通过层析方法制备含因子VIII的病毒灭活级分的一种方法，其中一从冷沉淀物或血浆开始一可任选随后用氢氧化铝处理，在冷沉淀物溶解后至少进行一个使用膜层析的分离步骤。
2.按照权利要求1的方法，其中所述分离步骤在膜内或膜上排列有离子交换材料上，特别是阴离子交换材料的膜上发生。
3.按照权利要求1和/或2的方法，其中病毒灭活是通过用二或三烷基磷酸盐和非离子表面活性剂处理所述级分进行的。
4.按照权利要求1至3之至少一个的方法，其中病毒灭活通过巴氏灭菌步骤实施，任选随后进行使用膜层析的附加分离步骤。
5.按照权利要求1至4的之至少一个的方法，其中所述膜层析在对因子VIII具有高亲和力的材料上发生。
6.按照权利要求1至5之至少一个的方法，其中对因子VIII具有高亲和力的该材料被具有高和/或低分子量的配基修饰。
7.按照权利要求6的方法，其中所述材料用针对因子VIII的抗体修饰。
8.按照权利要求5至7之至少一个的方法，其中对因子VIII具有高亲和力的该被修饰材料带有对因子VIII具有高亲和力的固定配基。
9.按照权利要求1至8中任意一项的方法，其中该层析材料能够与待分离的因子VIII起相互疏水作用或带有介导相互疏水作用的合适配基。
10.按照权利要求1至9中至少一个的方法，其中待提纯的样品在具有对应于0至150mM氯化钠的低离子强度的水性系统中上样于含离子交换材料的膜上，任选用具有对应于200至400mM氯化钠溶液的较高离子强度的水性系统洗涤，然后用具有对应于500至1500mM氯化钠溶液的高离子强度的水性系统洗脱，而pH值维持在4至9。
11.按照权利要求1至10的至少一个的方法，其中待提纯的样品从允许因子VIII结合于针对因子VIII的抗体的溶液被上样到上面带有被吸附的因子VIII的亲和膜被任选地洗涤，然后用相当于例如1至6M尿素的浓度的离液剂或用相应地更高浓度的盐溶液洗脱。
12.按照权利要求1至10的至少一个的方法，其中待提纯的样品溶于具有很高离子强度的溶液，加样至表面带有疏水配基的膜上，并用具有低离子强度的溶液系统洗脱。
13.按照权利要求1至12的至少一个的方法，其中含因子VIII的该被洗脱级分被浓缩，灌装和/或冻干。
14.按照权利要求1至13的至少一个的方法，其中所述病毒灭活是通过用重量比最多达15％的去污剂处理进行的。
15.一种含因子VIII的级分，通过应用按照权利要求1至14的至少一个的方法取得。
全文摘要
一种通过层析方法制备含因子Ⅷ的病毒灭活级分的方法，其中——从冷沉淀物或血液血浆开始——可能随后用氢氧化铝处理，在冷沉淀物溶解后至少进行使用膜层析的一个分离步骤。对该级分进行病毒灭活并优选进行附加的巴氏灭菌步骤。
文档编号C07K1/22GK1134157SQ94194020
公开日1996年10月23日 申请日期1994年9月30日 优先权日1993年11月4日
发明者A·斯特兰卡, M·A·斯塔德勒, D·约斯克 申请人:奥克塔法马有限公司
技术领域：
本发明涉及一种通过层析法制备含因子VIII的一种病毒灭活级分的方法，以及一种可通过按照本发明的方法得到的含因子VIII的级分。
因子VIII是一种在血凝中起重要作用的至关重要物质。血凝疾患因此可通过施用因子VIII治疗。因而，对可施用的因子VIII制剂的需求很大。已作了很多尝试以便从自然来源分离高度富含形式的因子VIII。因此，用于从冷沉淀物提纯因子VIII的层析法已是公知的。冷沉淀物是对血浆进行冷沉淀得的一种成分。EP 367840B1涉及一种从血浆中分离因子VIII而不预先进行冷沉淀的层析法。在经离子交换基团修饰的亲水性材料上经层析分离法分离该含因子VIII的成分。EP 0238701涉及一种用于制备超纯的、易传播的抗血友病因子的方法，其中经预处理的级分是一种用乙醇沉淀法从纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白和其它干扰成分中分离的冷沉淀物。欧洲专利申请88108458.6描述了在冷沉淀物级分的病毒灭活后用离子交换器层析进行分离。EP 0173242A描述了在仅基于碳水化合物的阴离子交换材料上通过层析法取得因子VIII制剂的方法，该碳水化合物基质被DEAE基团修饰。特别地，DEAEsepharose和DEAE纤维素按照用途被描述。在GB-A-1178958中，描述了一种使用ECTEOLA纤维素柱的因子VIII提纯法。该被修饰的纤维素包含由表氯醇和三乙醇胺反应引入的基础物质。上述先有技术应用批量层析或柱层析的形式进行层析分离。虽然用这些方法得到了相当好的结果，为经济的和伦理的原因还希望增加有生物学上价值的因子VIII的产量。
因此，构成本发明基础的技术问题在于提供一种方法，该方法从先有技术出发，能够在使因子VIII的制备在产量和生物活性方面得到提高。
令人惊异地，该问题已得到解决。以冷沉淀物或血液血浆为出发材料，可选择随后进行氢氧化铝处理，将冷沉淀物溶解后使用膜层析法进行分离。
本发明涉及方法的实施可采用商品冷沉淀物或血液血浆。优选地，将解冻的冷沉淀物用氢氧化铝处理，目的是对样品进一步预提纯以便预浓缩因子VIII。
优选地，在实际进行层析纯化之前，对排列在膜内或膜上的材料进行病毒灭活。该病毒的灭活按照在EP 131740A1中描述的方法通过用生物相容的有机溶剂(去垢剂)，Triton×100/TNBP，优选吐温/TNBP(三-n-丁基磷酸盐)处理而进行。采用Natriumcholat/TNBP也得到很好的结果。优选地，去污剂的用量最多达15％重量比。然而，病毒的灭活也可在用膜层析法分离后进行。
为提纯样品中的因子VIII，层析步骤可在经离子交换基团，特别是阴离子交换剂修饰的基础材料上进行，或在经免疫亲和配基修饰的材料上进行。关键的是，所述这些材料都是排列在膜上的优选地，这些膜由基底材料如经修饰的纤维素或塑料纤维制成。特别适用的是膜，和由多孔的多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)和/或其它具有类似结构的多孔亲水聚合物和亲水聚苯乙烯所制成的致密盘。
在第一种情况，适用于分离的膜或者由用纤维素或塑料纤维制成的堆积的薄膜组成，或者在第二种情况下它由用二氧化硅凝胶或多聚物载体制成的致密盘组成。该膜或盘的基底材料提供相应的阴离子交换基团或免疫亲和配基。特别地，阴离子交换基团如季胺或二乙胺乙基基团被当作离子交换基团。阳离子交换剂一般采用弱的和强的酸性阳离子交换剂，例如被磺酸或磷酸基团修饰的材料。
该离子交换基团可结合在基底材料纤维上，带或不带所谓的隔离物。提供隔离物的材料也被称为触须材料(Tentakelmaterial)。在DE 4204694中提到了相应的隔离物和配基。例如，一种糖胺残基也可用作一个隔离物。阴离子交换基团如DEAE或季胺也可结合在由多孔多聚物(甘油基甲基丙烯酸树脂)或其它被提及的材料制成的膜上。该阴离子交换基团的结合可直接在形成膜的材料上，也可通过一个隔离物如糖胺残基发生。
在本发明涉及的方法的另一实施方案中，使用了应用具有对因子VIII的高度亲和性的固定物质的亲和膜层析法。特别地，可能采用单克隆和/或多克隆抗体或抗体的因子VIII结合片段(免疫亲合膜层析)。优选该抗体来自人或鼠。
对因子VIII具亲和性的物质借助于化学性质活泼的基团被固定在载体上。优选地，该活泼的基团将攻击隔离物的末端面非直接攻击载体材料。对因子VIII的该物质的固定通过在活泼的基团例如甲苯磺酸，tresyl，酰肼和其它的结合而发生。相应的方法见于T.M.philips“层析法”(E.Heftmann，编)第5版；Elsevier，阿姆斯特丹1992中的“亲和层析法”。
该抗体也可在带有蛋白A或蛋白G配基的膜上被预吸附。通过随后的共价交联，可避免抗体的洗脱(流出柱子)。为在蛋白A或蛋白G膜上交联该抗体可使用与松驰的载体类似的方法。在蛋白A或蛋白G上固定的优点是该抗体仅被固定在分子的恒定片段(Fc)。因此，该抗原结合部分(Fab)保持游离并且其与因子VIII的相互作用未被妨碍。
在另一项优选的实施方案中，疏水相互反应的材料被保证用于分离因子VIII。所使用的疏水材料为开环的和/或环烷基链，例如C1至C18烷基链，和芳香族化合物。提供疏水相互反应的合适物质优选那些具有分级的疏水性者。疏水性可通过引入极性基团，例如质子极性或非质子极性基团，如羟基、胺基、氰基来分级。优选地，根据相应的分离条件选用。
也可通过热处理进行病毒灭活。优选地，含因子VIII的该被洗脱样品经第一次膜层析步骤后进行巴氏消毒步骤。在P 4318435.9中已提出一个相应的步骤。其中，富含因子VIII的级分在稳定剂存在下接触二或三烷基磷酸盐和可任选的湿润剂，并同时或随后在55℃至67℃范围的升高的温度下被处理5小时至30小时。将两种病毒灭活的方法，即用热和去垢剂处理，结合起来可能是有利的。
为了去除在巴氏灭菌步骤中置入的化学物质，可随后进行第二次膜层析。优选地，采用经DEAE或季铵化合物修饰的膜分离添加的稳定剂，DEAE和季胺化合物膜经隔离物排列在层析载体物质表面。另外，有可能将相应配基排列在没有隔离物的载体材料表面。在选择的条件下该稳定剂不被这种阴离子交换材料阻滞，而因子VIII被吸附在该层析材料上。
然后用有梯度上升的盐浓度的水溶剂系统洗脱因子VIII。
这样使用常规的方法，将取得的含因子VIII的级分浓缩，灌装必要时冻干。
优选地采用从具有低离子强度的溶液上样进行第一次膜层析分离步骤中分离得到的因子VIII。优选地，该水性系统具有相当于0至150mM氯化钠溶液的离子强度。在这样的离子强度下，因子VIII仍被吸附在层析材料上，而更弱地结合的杂质在具有相同离子强度的水性系统的洗脱下被洗掉。
本发明相关方法另一实施方案中，可使用具有相当于200至400mM氯化钠溶液的离子强度的水性系统进行被吸附的材料的提纯。然后用具有相当于500至1500mM氯化钠溶液的离子强度的水性系统进行因子VIII的解吸和该级分的洗脱，而pH维持在4至9的范围内。如果进行阳离子层析，优选在pH值小于6进行，而阴离子交换层析则宜在6以上的较高pH值下进行。
如果因子VIII的提纯是用免疫亲和膜层析法进行的，则，与使用离子交换材料的上述方法不同，洗脱是用离液剂(chaotropenreagenzien)或高浓度盐溶液进行的。优选地，在足以破坏对因子VIII具高亲和性的物质和因子VIII本身之间结合的离液剂或盐浓度下进行洗脱。在相应洗部系统中所述物质的浓度取决于因子VIII和其相应结合成分间的亲合力的强度。优选地，具有不太高的亲和力的抗体被用作免疫亲和配基。作为结果是，在具有较低变性能力的水性溶液条件下可发生洗脱。优选地，具有1至6M尿素，特别是2至4M尿素浓度的水性溶性，或相应的高浓度的盐溶液被用于从免疫亲和膜上洗脱因子VIII。
在疏水相互反应层析中，样品被加至具有很高离子强度的水性溶液中，如，高浓度的硫酸铵(高至4M的浓度)或氯化钠(高至5M的浓度)。特别地，洗脱是用较低离子强度的盐溶液梯度地或线性地进行。含有有机溶剂的水性溶液，特别是稀释的酒精溶液，也可为具有较低离子强度的溶液用于在疏水交叉反应膜层析中样品的洗脱。
本发明相关的方法令人惊异地保证了一种因子VIII的快速和不复杂的提纯，并同时得到高纯度和高产率。另外，如此得到的因子VIII的比活很高，是因为本发明相关的方法中活性因子的低变性。因此，通过本发明相关的方法能得到的含因子VIII级分是本发明的一个目标。
权利要求
1.通过层析方法制备含因子VIII的病毒灭活级分的一种方法，其中一从冷沉淀物或血浆开始一可任选随后用氢氧化铝处理，在冷沉淀物溶解后至少进行一个使用膜层析的分离步骤。
2.按照权利要求1的方法，其中所述分离步骤在膜内或膜上排列有离子交换材料上，特别是阴离子交换材料的膜上发生。
3.按照权利要求1和/或2的方法，其中病毒灭活是通过用二或三烷基磷酸盐和非离子表面活性剂处理所述级分进行的。
4.按照权利要求1至3之至少一个的方法，其中病毒灭活通过巴氏灭菌步骤实施，任选随后进行使用膜层析的附加分离步骤。
5.按照权利要求1至4的之至少一个的方法，其中所述膜层析在对因子VIII具有高亲和力的材料上发生。
6.按照权利要求1至5之至少一个的方法，其中对因子VIII具有高亲和力的该材料被具有高和/或低分子量的配基修饰。
7.按照权利要求6的方法，其中所述材料用针对因子VIII的抗体修饰。
8.按照权利要求5至7之至少一个的方法，其中对因子VIII具有高亲和力的该被修饰材料带有对因子VIII具有高亲和力的固定配基。
9.按照权利要求1至8中任意一项的方法，其中该层析材料能够与待分离的因子VIII起相互疏水作用或带有介导相互疏水作用的合适配基。
10.按照权利要求1至9中至少一个的方法，其中待提纯的样品在具有对应于0至150mM氯化钠的低离子强度的水性系统中上样于含离子交换材料的膜上，任选用具有对应于200至400mM氯化钠溶液的较高离子强度的水性系统洗涤，然后用具有对应于500至1500mM氯化钠溶液的高离子强度的水性系统洗脱，而pH值维持在4至9。
11.按照权利要求1至10的至少一个的方法，其中待提纯的样品从允许因子VIII结合于针对因子VIII的抗体的溶液被上样到上面带有被吸附的因子VIII的亲和膜被任选地洗涤，然后用相当于例如1至6M尿素的浓度的离液剂或用相应地更高浓度的盐溶液洗脱。
12.按照权利要求1至10的至少一个的方法，其中待提纯的样品溶于具有很高离子强度的溶液，加样至表面带有疏水配基的膜上，并用具有低离子强度的溶液系统洗脱。
13.按照权利要求1至12的至少一个的方法，其中含因子VIII的该被洗脱级分被浓缩，灌装和/或冻干。
14.按照权利要求1至13的至少一个的方法，其中所述病毒灭活是通过用重量比最多达15％的去污剂处理进行的。
15.一种含因子VIII的级分，通过应用按照权利要求1至14的至少一个的方法取得。
全文摘要
一种通过层析方法制备含因子Ⅷ的病毒灭活级分的方法，其中——从冷沉淀物或血液血浆开始——可能随后用氢氧化铝处理，在冷沉淀物溶解后至少进行使用膜层析的一个分离步骤。对该级分进行病毒灭活并优选进行附加的巴氏灭菌步骤。
文档编号C07K1/22GK1134157SQ94194020
公开日1996年10月23日 申请日期1994年9月30日 优先权日1993年11月4日
发明者A·斯特兰卡, M·A·斯塔德勒, D·约斯克 申请人:奥克塔法马有限公司
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