专利名称：蛋白质的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域。特别是，涉及应用固定的金属亲合层析技术纯化补体受体蛋白质。本发明的背景技术以往，纯化蛋白质的方法是由这种欲纯化蛋白质与废弃蛋白质杂质分子的大小、电荷和溶解性这些性能的不同所决定的。基于这些参数的方法包括分子排阻层析法、离子交换层析法和差示沉淀法等。
分子排阻层析法，也可以称做凝胶过滤层析法或凝胶渗透层析法，它的机理是流动相中的大分子渗透到固定相颗粒的孔隙中。渗透差是颗粒的流体动力学体积的函数。因而，在理想的条件下，当小分子进入到颗粒体内时大分子被排阻到颗粒外部。洗脱容积与分子量的对数呈线性关系，所以可以根据蛋白质的大小确定洗脱顺序。分子排阻层析法的支持剂主要为交联葡聚糖如SEPHADEX，珠状琼脂糖颗粒如SEPHAROSE(二者均可在瑞典Pharmacia AB.Uppsala买到)，交联聚丙烯酰胺如BIOGEL(可从加利弗尼亚，Richmond，BioRad药厂买到)，或乙二醇异丁烯酸共聚物如TOYOPEARL HW65S(可从日本东京ToyoSoda买到)。它们都可用于本发明的实施。
沉淀方法取决于在蛋白质粗混合物中各个蛋白质的溶解性可能存在的极大的不同。尽管蛋白质在水介质中的溶解性受多种因素影响，但为讨论起见，通常认为如果蛋白质与溶剂间的相互作用强于与相同的或类似的蛋白质分子间的相互作用则这种蛋白质为可溶性的。不局限于任何描述沉淀现象的特殊机制学说，有人认为蛋白质与水分子间的相互作用是通过氢与几种无电荷基团结合以及氢与带电荷基团静电结合为偶极而产生的，沉淀物如单价阳离子的盐(如硫酸铵)与蛋白质竞争水分子，因此，在高盐浓度下蛋白质“脱水”，与水之间的相互作用减弱，与相似蛋白质的聚集增加，导致从介质中沉淀出来。
离子交换层析法涉及样品中的带电官能团与带相反电荷的离子官能团在吸附表面的相互作用。已知有两种普通类型的相互作用。阴离子交换层析法是通过带负电荷的氨基酸支链(如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的吸附表面产生相互作用而完成的，阳离子交换层析法是通过带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)与带负电荷的吸附表面产生相互作用而完成的。
最近开发的亲合层析技术和疏水性相互作用层析技术进一步补充了较为传统的分子排阻层析法和离子交换层析法。亲合层析的依据为蛋白质与一种固定配体间的相互作用。在这种配体为一种底物，底物类似物，抑制剂或抗体的情况下，它对于特殊蛋白质能是特异的。另一方面，这种配体还可以与大量的蛋白质发生反应。象一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟碱腺嘌呤二核苷酸或某种染料的常用配体均可用于回收一种特殊类型的蛋白质。这种亲和层析法中至少的生物特异性之一是固定的金属亲合层析技术(IMAC)也可以称作金属螯合层析法。Porath et al.，(Nature 258598-99(1975)中介绍的IMAC涉及将一种金属与一种固体支持剂螯合，然后与欲分离蛋白质表面的电子供体氨基酸残基形成一种复合物。
疏水性相互作用层析法的首次开发源于一种观察即蛋白质可在包含有碳氢化合物连接臂(spacer arm)但不含有亲合配体的亲合凝胶上保留。尽管在本领域中有时使用疏水性层析法的名称，但较好的名称为疏水性相互作用层析法(HIC)，因为这种溶液与凝胶之间的相互作用是疏水性过程而不是色谱分析过程。在高离子强度下疏水性相互作用非常强，因此，在盐沉淀或离子交换之后很容易完成这种形式的分离。通过改变溶剂、pH值、离子强度或者通过加入高离液序列或有机调节剂如乙二醇能够实现从HIC支持剂上的洗脱。有关疏水性相互作用层析法的基本原理的描述可以在美国专利3,917,527和美国专利4,000,098中看到。下列的公开的参考文献中举例说明了HIC在纯化特异性蛋白质中的应用人的生长激素(美国专利4,332,717)，毒素共轭物(美国专利4,771,128)，抗溶血因子(美国专利4,743,680)，瘤坏死性因子(美国专利4,894,439)，白细胞介素-2(美国专利4,908,434)，人的淋巴毒素(美国专利4,920,196)和溶菌酶种类(Fausnaugh，J.L.和F.E.Regnier，J.Chromatog.359131-146(1986)。
本发明是将离子交换法，IMAC，HIC和分子排阻层析法结合起来用于补体受体分子和补体受体相似分子的纯化。本发明的简单描述本发明涉及一种从含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括把该混合物依次与一种阳离子层析支持剂、金属亲合层析支持剂、分子排阻层析支持剂相接触并且选择性地从每一种支持剂中洗脱出这种蛋白质。
另一方面，本发明提供了从含有一种补体受体蛋白的细胞条件培养基中纯化这种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括对这种培养基进行依次处理(a)最初的阳离子交换层析，(b)固定的金属亲合层析，(c)疏水性相互作用层析，(d)阴离子交换层析，以及(e)排阻层析。
另一方面，本发明提供了从细胞的条件培养基中纯化一种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括(a)浓缩细胞的条件培养基；(b)把补体受体蛋白质吸附在一种阳离子层析支持剂上；(c)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白质；(d)在一种固定的金属亲合层析支持剂上洗脱冲洗过的蛋白质；(e)吸附从(d)步骤中洗脱的蛋白质；(f)用至少一种缓冲液冲洗吸附的蛋白质；(g)洗脱冲洗过的蛋白质；(h)在一种疏水性相互作用层析支持剂上吸附从步骤(g)中洗脱过的蛋白质；(i)选择性地洗脱这种蛋白质；(j)在一种阴离子交换支持剂上吸附从步骤(h)中洗脱的蛋白质；(k)洗脱吸附的蛋白质；(l)对步骤(k)中的洗脱物进行分子排阻层析；(m)由此回收这种蛋白质。本发明的详细描述本发明涉及蛋白质的纯化技术，这种技术可应用于补体受体蛋白质的大规模纯化。因为它可以获得蛋白质纯度＞95％的受体蛋白质，所以特别有用。本发明还可以用于大量补体受体蛋白质及补体受体类似物蛋白质的纯化。
补体是一组血清蛋白，可被有限蛋白水解依次激活，是人体免疫的重要因子。补体的活性是由早期活性补体成分与抗原/抗体复合物相互作用而产生的。激活后的蛋白水解片段单独或与其它蛋白一起激活其它的补体成分，引起一种蛋白水解的连锁反应，此反应过程与凝血因子的活动相似。或者，通过细菌细胞壁成分，蛋白水解酶(如血纤维蛋白溶酶)或复合碳水化合物(如旋复花粉)激活补体。补体系统的成分能够调节许多生物活性作用(如免疫胞溶，过敏毒素的产生，溶菌作用，趋化作用，溶血作用，调理作用和吞噬作用)。
CR1-CR4为已知的四型补体受体(CR)。补体受体1(CR1)是补体成分C3b和C4b的受体，补体受体2(CR2)是补体成分C3dg或C3d的受体，补体受体3(CR3)是补体成分C3bi的受体，补体受体4(CR4)是补体成分C3dg的受体。
1型补体受体(CR1)存在于红细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、B细胞、某些T细胞、脾滤泡树突状细胞以及肾小球内的足状突细胞的细胞膜上。CR1连接C3b和C4b并称之为C3b/C4b受体。它的初级序列已经确定(Klickstein et al.，J.Exp.Med.1651095-1122(1987)，Klickstein et al.J.Exp.Med.1681699-1717(1988)，Hourcade et al.J.Exp.Med.1681255-1270(1988)。它是由30个含60-70个氨基酸的短concensus repeats(SCR)组成，其中保存有29个SCR，每个SCR平均含有65个氨基酸。有人认为每个SCR通过二硫键形成一个三元三维环状结构，这种结构是以二硫键把第三和第一和第四和第二个半胱氨酸连接形成的。这些SCRs进一步组成4个长类似复制(homologous repeats)(LHR)，每个LHR由7个SCRs组成在顶枝序列之后，该分子由含有一个C4b连接区的多个N端的LHR-A，接着是两个重复片段，含有3b连接区的LHR-B和LHR-C以及多个C端的LHR-D组成，随后有2个附加的SCRs，一个是含有25个残基的公认转换膜区域和一个43个残基的细胞浆末端。
CR1是具有SCR同系现象总族中的一员。这个总族包括具有一种C3/C4结合功能的成员，如CR2，C4bp，H因子，B因子和C2，还包括没有此功能的蛋白质，如白介素-2受体，b2-糖蛋白I，Clr，结合珠蛋白的一条链以及XIIIb因子。
CR1已知为一种糖蛋白，推测其氨基酸序列具有24个位点，此位点用来结合胞外区域的N-联寡糖。但是，衣霉素条件下的CR1合成(Lublin et al.J.Biol.Chem.2615736(1986))和氨基葡糖内容物的分析(Sim，Biochem J.232883(1985))推测实际只有6-8个位点用于联接寡糖。糖蛋白的N-端似乎被封闭。
CR1存在四种不同的同种异型，其区别在于大小按30-50kD增加。在人群中这些同种异型的基因频率不同(Holter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842459-2463(1987))。F(或A)型同种异型由4个LHR组成，其大小约为250kD；较大的S(或B)型同种异型含有第5个LHR，它是一个LHR-B5′端的一半和LHR-A3′端的一半的嵌合体，可推测出它有一个C3b的第三结合位点(Wong et al.J.Exp.Med.169847(1989))，其大小约为290kD。最小的F′(或C)型同种异型在全身性红斑狼疮(SLE)病人中发生率较高(Van Dyne et al.，Clin.Exp.Immunol.68570(1987)和Dykman et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 801698(1983))，这很可能是由LHR-B和一个C3b结合位点的缺失所引起的。
在正常人和具有SLE的某些病人的血浆中已经发现一种天然可溶型CR1(Yoon & Fearon J.Immunol.1343332-3338(1985))。在结构和功能上它们的特征与那些红细胞(细胞表面)的CR1的都很相似。
Hourcade等(J.Exp.Med.1681255-1270(1988)还在人的CR1转录单位上观察到一个可替代的多腺苷酰化位点，可推测出这个转录单位可产生一种分泌型CR1。这个截断序列所产生的mRNA包括第一位的8.5个SCR；如C4b结合区，并能够编码一种约80kD的蛋白质。当把一个与此截断序列相应的cDNA转染入COS细胞并且表达时，表现出所期望的C4b结合活性，而非C3b结合活性(Kyrch et al.F.A.S.E.B.J.3A368(1989)。Krych等还观察到一种与几种人体细胞系中推测的相似的mRNA，并推断在人体中能合成这种能够结合C4b的可溶型CR1截断序列。
借助重组DNA的方法从被表达出的DNAs中删除转换膜区域也可以产生一些可溶性CR1片段(Fearon等国际专利公开号WO 89/09220，1989年10月5日公开以及Fearon等的国际专利公开号WO 91/05047，1991年4月18日公开)。这些可溶性CR1片段具有活性功能，它们能够结合C3b和/或C4b，并表现出I因子辅助因子的活性，这些活性依它们所包含的区域而定。另外它们能够作为CR1的功能如中性粒细胞氧化破裂，补体介导溶血以及C3a和C5a的产生的体外抑制剂。一种由质粒sCR1/pBSCR1c编码的可溶性CR1结构还在体内的反向被动阿图斯反应中表现出活性(Feuron et al.1989 & 1991以及Yeh etal.J.Immunol(1991))，并且能抑制分泌物潴留后的心肌炎症和坏死(Fearon et al.1989 & 1990以及Weisman et al.，Science 249146-151(1990))。再者，SCR1/pBSCR1c产物与对甲氧苯酰化的人纤维蛋白溶酶原-链激酶-激活性复合物(APSAC)的共同制剂具有与单独的APSAC相似的抗溶血活性，这表明将这种补体抑制剂SCR与一种溶栓剂组合是一种有用的联合治疗(Fearon等，国际专利公开号WO 91/0504
公开日1991，4，18)。
补体受体类似蛋白质是指可以用本文所描述的方法可纯化的蛋白质，如果需要该方法可以通过常规的非发明性的调整进行改良，并不需要做太多的实验。这类蛋白质包括多个CR的同种异型和等位基因，截断类型，化学修饰类型如经过PEG处理的以及含有一个CR部分的核聚变蛋白质。这些蛋白质称为补体受体类似物，因为它们具有或保留了CR蛋白质的特性，足可以用本发明的方法纯化。除非有特殊限定，补体受体蛋白质术语还包括补体受体类似蛋白质。CR-1类似蛋白质代表CR-类似蛋白质的一个亚型，它包括来源于CR-1的同种异型的等位基因、截断类型、化学修饰类型以及核聚变蛋白质。可溶性补体受体1(sCR1)，本文中被认为是含有全部30个细胞外SCR区的人CR1的一种可溶性类型，它是CR-1类似蛋白质中的一个特例。
用各种技术能够制造出本发明的补体受体蛋白质。如果需要完整的天然链，可以从上面确定的细胞来源中提取天然分子。如果需要的是可溶性类型，优选天然完整分子的片段。因而，编码所需链片段的DNAs被表达为重组方式产生的蛋白质片段。本发明对从各种可以产生sCR1重组细胞系的细胞条件培养基中纯化sCR1特别有用。虽然可以在本文公开的内容基础上，想到细胞系以及补体受体产物的某些变化，但是调整本发明以适应一个补体受体蛋白质和所产生的细胞系的特别组合，却在本领域普通技术人员所能想到的范围之内。
通常，编码蛋白质如补体受体的基因是通过把编码所需多肽区域的DNA片段并入到一个重组DNA载体(如媒介动物)中，并且转化或转染适宜的原核生物或真核生物宿主来克隆的。适宜的原核生物宿主包括但并不局限于Escberichia，Streptomyces，Bacillus等等。适宜的真核生物宿主包括但并不局限于酵母菌，如Saccharomyces以及培养基中的动物细胞如VERO，Hela，小鼠C127，中国大田鼠卵巢(CHO)，WI-38，BHK，COS，MDCK，和昆虫细胞系。特别优选的宿主为缺乏二氢叶酸还原酶的CHO细胞系如ATCC CRL 1793，CRL 9096以及如下所述的其它细胞系。现在这种重组技术已经众所周知并且在Methods in Enzymdoog(Academic Press)，卷65和69(1979)，100和101(1983)中有所描述，其中还列举了参考文献。在Maniatis等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)和Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing(1988，1991)中可以找到使最常用的重组DNA整套方法的许多技术讨论。
把cDNA克隆化是获得一个可以编码一个所需多肽如一个补体受体的DNA片段的方法之一。在此过程中，可以将信使RNA(mRNA)从已知或推测能够产生所需蛋白质的细胞中分离出来。通过一系列的酶催化反应，把细胞的mRNA群复制到一条互补DNA(cDNA)中。然后将所得cDNA植入克隆载体，之后用于转化一个适宜的原核生物或真核生物宿主。所得cDNA“文库”是由一群转化后的宿主细胞组成，每个宿主细胞含有一个基因单体或一个基因片段。从理论上讲，这个全部文库提供了一个具有代表性的编码信息样本，其存在于用作起始物质的mRNA混合物中。
使用核酸或抗体探子筛选这些文库以便确定特殊的DNA序列。一旦分离出来，这些DNA序列可以被修饰或者装配成完整基因。或者，正如本发明所述，基因的特异性片段可以不依赖于这个基因的其它部分而独立装配。尽管由这些装配后的基因片段编码的蛋白质片段不能在自然界中发现，但是它们在治疗不希望的生理疾病方面却有重要用途。能够用于预防和/或治疗与补体活性有关的序列的紊乱的可溶性补体受体的遗传工程学就是其中的一例。
基因或基因片段一经克隆化，DNA就可以转入一个表达载体，这种结构可以用于转化一个适宜的宿主细胞。表达载体是以具有如本文所定义的表达控制序列为特征的，所以当一个有关的DNA序列有效地联接到载体上时，这个载体就能够控制产生一种产物，这种产物是由与含有这个载体的宿主细胞有关的DNA序列编码的。与本发明特别有关的是一旦形成表达一种可溶性受体蛋白，装配这种单克隆序列的片段也就成为可能。这种方法在SCR1重组生产上的特别有效的应用可见上文援引过的Fearon等的PCT申请WO 89/09220，1989年10月5日公开以及WO 91/05047，1991年4月18日公开的文献。
产生重组产物之后需要将其分离出来。如果这个产物是由产生它的细胞运送的，那么可以直接从细胞培养中将其分离出来。如果这个产物仍留在细胞内，那么必须通过机械、化学或生物的方法完全地破坏细胞以获得这个细胞内产物。
如果是一种蛋白质产品，这种纯化方法不仅能提供一种基本上不含其它蛋白质的产品，也就是说在制剂中这种蛋白质在总蛋白中的纯度至少为80％，最好大于95％，而且还要除去其它宿主细胞杂质，DNA，RNA，潜在热原等等，或者将它们降低为可接受的水平。
如上所述，多种宿主细胞均可用作生产本发明的受体。首先考虑到受体的性质，合成率，衰败率以及能够引发这种受体表达的重组载体的特性诸方面，选择一个特殊的宿主细胞在普通技术人员的能力范围之内。所选择的宿主细胞表达系统在很大程度上决定着所使用的细胞培养方法的性质。一旦选择了表达系统，也就选择了一种一次性或连续性，螺旋式或空气式提升的，流动性或固定性生产模式。因而，可以使用流动层生物反应器，空心丝生物反应器，滚动式培养瓶，或者搅拌釜生物反应器，可以有也可以没有细胞微载体。这种选择的标准在细胞培养领域中是可以想到的。因为这不属于本发明的范畴，所以不在此详述。本发明涉及存在于一个可调节的细胞培养基中的补体受体的纯化。
如上所述，本发明涉及固定的金属亲合层析(IMAC)在补体受体蛋白质纯化中的应用。IMAC的原理是通常可想到的。人们认为在一个金属离子与位于所要结合的蛋白质的表面可接近的电子给体氨基酸之间形成一种金属配位化合物来决定吸附的，该金属离子是由吸附基质上的螯合作用固定的氨基酸。金属离子微包绕物包括并不局限于基质，隔离杆(即使有也极少)，螯合配体，金属离子。普通技术人员能够控制周围的流动培养基和溶解状态的可溶性品种的特性以改变所需的分离等级。
并非局限于任何特殊的机制理论，人们进一步认为就结合而言较重要的氨基酸残基为组氨酸、色氨酸、也可能为半胱氨酸。如果在蛋白质中找到一个或多个这种残基，就可以推测所有蛋白质与IMAC柱结合。尽管如此，对发生有效结合来说，这种残基不仅必需存在而且还应当是可以接近的(如位于蛋白质的表面)。最后，本发明还考虑到其它适于补体受体蛋白的残基。通过美国专利4,569,794中所描述的下列的方法将残基装配进本文所述的重组表达系统中，如加到蛋白质的氨基端或羧基端的聚组氨酸尾部。
金属的性质以及在柱上的配位方式也可以影响这种结合反应的强度和选择性。硅胶基质，琼脂糖以及有机合成分子如聚乙烯异丁烯酸共聚物均可使用。这种基质最好含有促进螯合的取代基。可以使用象亚氨基二乙酸(IDA)或它的三(羧基甲基)亚乙基二酰胺(TED)的取代基。IDA为优选。一种特别有用的IMAC物质为Toyopearl AF-Chelate 650M，它是一种用IDA取代的聚乙烯异丁烯酸共聚物。虽然Co 、Ni 、Cd 和Fe 均可使用，但优选到锌为止的第一过渡系元素中的二价金属。当然，一个重要的选择参数是此金属与欲纯化蛋白的亲合力，Cu 为优选。在这些金属离子周围的四个配位位置中，至少有一个被一个水分子占用，这个水分子在弱碱性pH下容易被一个较强的电子给体如一个组氨酸残基取代。
在实践中，用金属盐浓溶液脉冲给IMAC柱装上金属然后用水或缓冲液过柱。该柱常常显示出金属离子的颜色(锌除外)。通常，金属数量的选择以大约能够装满柱的一半为准，这使金属离子能够缓慢地滴入未装区域而不会进入洗脱液中。在此之前通常用欲洗脱缓冲液进行预冲洗。为了使非特异性离子交换作用降低到最小，样品缓冲液应该含到1M或更多的盐。在较高pH的情况下蛋白的吸附作用达到最大。洗脱通常是通过降低pH值以使被吸附蛋白上的供电子原子团质子化，或者是通过在pH9条件下利用较强的配位剂如咪唑或甘氨酸。在后种情况下，可以从柱中置换金属。使用线性梯度洗脱方法也有很大益处。
如上所述，IMAC是一种特别适用于结合有其它蛋白质物质的纯化技术。也就是说，将IMAC用于已经用其它蛋白纯化方法部分纯化后的物质更为适合。“部分纯化的”一词的含义是一种蛋白制剂，其中有益蛋白质的重量百分比至少为5％，至少10％较好，至少45％更好。因而，在上下文中对IMAC的应用大加推崇，因为它是一种能完全纯化补体受体蛋白的方法。美国专利申请流水号第857,002，1992年3月24日公开的文献公开了一种特别有用的联合层析方法，此处将其引用为参考文献。例如，在使用IMAC之前使一个细胞条件培养基样本接受部分纯化，这已经被发现很有益处的“细胞条件培养基”一词的含义是一种支持细胞生长和/或细胞修复的细胞培养基，它含有分泌产物。在使用IMAC步骤之前先对此培养物的浓缩样本进行一步或多步蛋白纯化。可以将对样本进行离子交换层析作为第一步。如上所述，可以将多种阴离子或阳离子取代基加在基质上以形成层析用阴离子或阳离子支持剂。阴离子交换替代物包括二乙基氨基乙基(DEAE)，季铵乙基(QAE)以及季胺(Q)基团。阳离子交换替代物包括羧基甲基(CM)，磺乙基(SE)，磺丙基(SP)，磷酸盐(P)以及磺酸盐(S)。纤维素离子交换树脂如DE23，DE32，DE52，CM-23，CM-32以及CM-52均可从Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.中得到以SEPHADEX为主，而交联离子交换剂也是已知的。如DEAE-，QAE-，CM-，和SP-SEPHADEX以及DEAE-，Q-，CM-和S-SEPHAROSE均可从Pharmacia AB中得到。而且，来源于乙二醇异丁烯酸共聚物的DEAE和CM，如TOYOPEAPL DEAE-650S和TOYOPEARL CM-650S均可从Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa中得到。因为来源于离子支持剂的洗脱通常包括加盐，而且在增高的盐浓度下会增强如前所述的IMAC，所以在经过离子交换层析步骤或其它盐介导的纯化步骤之后进行IMAC步骤为优选方案。其它纯化方法也可以加入，包括并不局限于HIC，进一步离子交换层析，分子排阻层析，病毒灭活，浓缩和冷冻干燥。
在水溶剂中疏水性分子将会自身缔合。这种缔合是由于疏水性相互作用而产生的。现在认为大分子如蛋白质除具有能够推测的疏水性基因外，还在其表面存在大量疏水性碎片。HIC部分是由这些碎片与附着与层析支持剂上的疏水性配位体的相互作用产生的。一种与一个基质结合的疏水性配位体本文也可以称为HIC支持剂，HIC凝胶或HIC柱。进一步认为蛋白与HIC支持剂之间的相互作用的强弱不仅是蛋白质上非极性和极性表面的均衡的作用，而且还与非极性表面的分布有关。
许多基质均可用于HIC柱的制备，其中应用最多的是琼脂糖。硅和有机聚合物树脂均可使用。可用的疏水性配位体包括并不局限于含有2-10个碳原子的烷基基团，如丁基、丙基或辛基；或者为芳基如苯基。用于凝胶和柱的常规HIC产品可以从市场上的商品中得到，如Pharmacia LKB AB，Uppsala，瑞典生产的商品名为丁基-SEPHAROSE，苯基-SEPHAROSECL-48，辛基-SEPHAROSEFF以及苯基-SEPHAROSEFF的商品；日本东京Tosoh公司生产的名为TOYOPEARL丁基-650，乙醚-650或苯基-650(Fractogel Tsk丁基-650)或TSK-GEL苯基-5PW的商品；Miles-Yeda，Rohovot，以色列生产的名为烷基琼脂糖的商品，其中烷基含有2-10个碳原子，以及J.T.Baker，Philipsburg，N.J.生产的名为BakerbondWP-HI-丙基的商品。
配位体浓度是一个不仅影响相互作用的强度而且影响柱的层析能力的重要参数。市场上可以得到的苯基、辛基苯基凝胶的配位体浓度为每毫升凝胶层含有40微摩尔凝胶。凝胶的层析能力是正被谈论的特定蛋白以及pH、温度和盐浓度的函数，但是，人们常希望它能落在3-20mg/ml的范围内。
本领域的普通技术人员能选择一种特殊的凝胶。通常，蛋白与HIC配位体间的相互作用力的强弱随着烷基配位体的链的长度的增加而增加，但是对大多数分离来讲，含有4-8个碳原子的配位体较为适宜。尽管由于苯基与蛋白质上的芳基间的pi-pi相互作用的可能性这种选择性有很大不同，但是苯基和戊基却具有相同的疏水性。
虽然，蛋白质与HIC柱的吸附作用在高盐浓度下较好，但是准确的浓度却可以根据此蛋白与所选用的HIC配位体的性质在一个较大的范围内变化。可以根据它们是否能促进疏水性相互作用(盐析效应)或破坏水的结构(离液效应)在一个被称为憎溶系中选择离子并且能导致疏水性相互作用减弱。在盐析效应增强方面，阳离子的排列顺序为Ba ＜Ca ＜Mg ＜Li ＜Cs ＜Na ＜K ＜Rb ＜NH4 。而在离液效应增强方面，阴离子的排列顺序为PO---＜SO4--＜CH3COO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。
因而，将影响相互作用强弱的盐用下列关系式给出它们的关系Na2SO4＞NaCl＞(NH4)2SO4＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN通常使用的盐浓度为硫酸铵约0.75-2M，NaCl约1-4M。
虽然温度的下降可引起相互作用的减弱，但是温度对HIC分离的影响却很复杂。不管怎样应该加大任何有利因素以对抗如在蛋白活动中产生的相反作用的增强，这些有利因素是随着温度的增加而增强的。
无论是分步洗脱还是梯度洗脱均可用许多方法完成(a)通过改变盐的浓度，(b)通过改变溶剂的极性，(c)通过加入洗涤剂，通过降低盐浓度以疏水性作用增加的顺序洗脱被吸附的蛋白。通过加入如乙二醇或(异)丙醇的溶剂由此减弱疏水性相互作用，以改变溶剂的极性。洗涤剂的作用为置换蛋白，主要用于有关膜蛋白的纯化。
当对经过HIC的洗脱物进行进一步的离子交换层析时，阴离子方法和阳离子方法均可使用。
如上所述，凝胶过滤层析是对基于分子大小的分离起作用，它是以筛选分子的形式起作用的。人们希望基质与所存在的溶质之间无相互作用，因而可优选所有的惰性基质。人们还希望基质硬而且为大孔。大规模生产时，其硬度尤为重要，因为这个参数与最终的流速确定有很大关系。传统的物质如SEPHADEX或BIOGEL虽有足够的惰性且孔的大小符合要求，但这些凝胶相对较软而且尤其不适合大规模的纯化。最近开发了一些硬度增加的凝胶(如SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL和SUPEROSE)。所有这些基质产品的颗粒大小小于那些可得到的传统支持剂，从而即使在较高流速下仍保持再溶解。优选TOYOPEARL HW系列基质(Toso Haas)。
本发明可用于溶解型补体受体的纯化仅仅是为了详细说明本发明的目的。具体地说是将其应用于一个最多包含前导链，LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30区域并包括转换膜区域的第一丙氨酸残基的可溶性CR1结构，这与Fearon等；1989，国际专利公开号WO 89/09220，
公开日1989年10月5日文献中描述的用于质粒pBSCR1c中CR1编码序列相一致(此后称为“TP10HD”)。这种TP10HD产品的重组系统的结构在上述的PCT申请中有详细描述，总结如下。
用胰蛋白酶处理CHO细胞，在平皿中培养出一个每60mm 5×105的盘，放入生长培养基中，在37℃，5％CO2/P5空气的气压下，在可调湿的孵化器中培养(这种生长培养基为Hams F12营养培养基(041-1765)，含1％普通的谷氨酸(043-05030)、1％普通的pen/strep(043-05070)以及10％小牛血清(011-6290)，Gibco，Paisley，苏格兰生产)。21小时后将此细胞用于DNA转染。用pSV2dhfr将一个来源于pBSCR1c含有sCR1编码序列的表达质粒一起转染入一个需要dhfr的中国Hamster Ovary细胞系(CHODUXBII)。转染在生长培养基中进行，并且使用了如DNA Cloning，D.M.Glover ed.(Chap.15，C.Corman)中所述的钙共同沉淀或甘油冲击方法。在用pBSCR1c/pTCSgpt和pSV2dhfr转染之后，开始选择之前，将细胞在生长条件下(如上所述在生长培养基中继续保存46小时。
选择和共同增强的进行基本如R.J.Kaufman，等(Mol.Cell.Biol 51750-1759(1985)所述。转染后46小时细胞变为选择性培养基MEM ALPHA(041-02571)，它含有1％普通谷氨酸、1％普通pen/strep(043-05070)以及经过渗析的胎牛血清(220-6300AJ)(Gibco，Paisley，苏格兰生产)。将细胞在选择性培养基中保存8-10天直到dhfr 克隆出现，当建起克隆时，细胞变为含有氨甲蝶呤的选择性培养基(A6770，Sigma Chem.Co，St.Louis，Mo.)。氨甲蝶呤的浓度开始为0.02μM，以后逐步增加到5μM。在放大过程中用来源于生长细胞的生长培养基的等分试样测定ELISA生产的TP10HD。按照本发明，任何能分泌重组细胞系(如ATCC CRL10052)的补体受体均可用来提供纯化用的条件培养基，当然不需要一个特别的细胞系。
培养一个能够产生TP10HD的转染CHO细胞系可以采用多种细胞培养技术。对本发明的应用而言，培养的特殊方法并不是重要的，但为了详细说明的目的，可用的细胞培养的一种方法是一种连续灌注法，此方法基于如美国专利4,861,714；4,863,856；4,978,616以及4,997,753中所载的Verax流动层技术。其内容本文引用为参考文献。因而，如上所述的转染细胞在用10％胎牛血清(FBS)和5mM氨甲蝶呤(MTX)补充的CCM-3培养基中递增，CCM-3培养基为DMEM，Ham′s F-12，牛血清白蛋白和其它营养性添加剂的混合物。在辊式瓶中扩大细胞群落直到产生足够的细胞以用于孵化一个生物反应器。
在孵化一个S200生物反应器之前进行器皿的清洁和蒸气消毒环节。然后用含有5％FBS的CCM-3填充并加入450g微球体。在孵化之前用培养基调节微球体。用细胞孵化此反应器，其操作参数为pH7.2，37℃，进口含氧100-400torr(进口是指流动层的底部)，出口含氧0-200torr(出口是指流动层的顶部)。继初相之后，进行培养基灌注，灌注率逐渐增加以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。如此连接灌注直到在反应器中积累了足够量的细胞以孵化一个S2000生物反应器。CTP和SIP之后，将加有5％FBS和5mM MTX的CCM-3培养基装入S-2000反应器中，并且加入5000g微球体。在孵化之前用培养基湿润此微球体。温度、反应设计和含氧量方面的操作条件如上所述。将S-200反应器中的微球体无菌地转入S-2000反应器以建立初相。当葡萄糖的浓度下降到1.5g/L以下时，通过一定流速的介质(CCM-3，5％FBS和5mM MTX)灌注启动生长相以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。通过测氧摄入率和葡萄糖消耗率来用曲线监测细胞的生长。当反应器的细胞积累到足够的数量时，灌注的培养基改为加有1％FBS和5mM MTX的CCM-3的一种过渡培养基。再次增加灌注率以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。在过渡性培养基中进一步生长之后，将灌注培养基再改为生产培养基，加有5mM MTX的CCM-3。增加灌注率以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。此后降低给定的出口含氧量或者循环流率以结束反应器的反应。生产相一般持续60天左右。
将400-1600升4-8℃下保存的的反应渗透剂穿过一个Millipore Prostak微过滤装置。对从此操作中得到的细胞外渗透剂进行超过滤。用Millipore Spiral Mound装置将渗透剂浓缩30-60倍。浓缩后，将残余物排入一个收集箱中，并将5-20L pH为7.5的50mM磷酸缓冲液装入该系统中。从系统中排出冲洗缓冲液并与残余物结合。将超过滤浓缩液通过一个预过滤器和一个终端为0.22mm的过滤器，滤入一个预先高压灭菌的Nalgene瓶中。通常每瓶装浓缩液800ml，冷冻保存。
如前所述，这种特殊的重组生产系统和细胞培养方法不在本发明范围内。上面讨论的系统和方法是本领域普通技术人员所能使用的许多方案中具有代表性的，本文包括它们仅为了详细说明发明目的。例如，从搅拌釜反应器中得到的介质同样适合作为用于本发明的条件培养基的来源物。本发明的主题是对纯化方法作常规修改，将其用多种重组补体受体蛋白和补体受体类似蛋白的纯化，与怎样生产或培养的这些蛋白无关。
应用本发明的方法所获得的纯化补体受体蛋白具有以下特性1)CR蛋白大于95％重量百分比；2)在4℃下蛋白分解作用可保持稳定至少三个月；3)低内毒素(每mg蛋白＜1E.U.)；4)低DNA(每mg蛋白＜1pg)；5)非CR蛋白小于5％；6)病毒灭活。
下列实施例用来进一步说明本发明，并不作为对权利要求的限制。
实施例I内容介绍下面概括的方法可以用于从细胞条件培养基浓缩物中分离和纯化可溶性补体受体-1(sCR1)。设计此方法为当去掉来源于宿主细胞、细胞培养基或其它原料的杂质时可以制备出蛋白纯度大于95％的sCR1。此回收方法由九步组成，其中包括阳离子和阴离子交换、固定的金属亲合、疏水性相互作用和分子排阻层析，以及二种病毒灭活处理。每一步详细描述如下，包括原料、方法和所期望的结果。1至3步在2-8℃下完成，6-9步在18-25℃下完成。所有的缓冲液在使用之前均用WFI调制并且经过一个10,000 MWCO过滤器的过滤。通过柱上显示的280nm紫外吸光度和传导性调节所有柱。在使用前洁净并平衡柱，每次使用后用NaOH洁净并在其中保存。
将此方法规模化以适应含有100G粗sCR1的近1000L培养基的需要，完成此套方法需7-14天，具体根据生产规模而定。第一步介质的预处理边搅拌边以1-3L/min的速度加入1M乙酸，使1000L细胞外条件培养基的pH值下降到5.2。所需乙酸的体积约为介质体积的3％，需要加15-30分钟。此后不断监测pH值。pH值的调节会产生大量沉淀。经过两串联(0.5微米)的Millipore 30英寸Polygard-CR过滤器微过量而澄清。在滤液中回收sCR1，当滤液积累到50-100L时开始第二步。可使过滤和装载同时进行。
将非sCR1蛋白和非蛋白类物质从酸化和过滤的介质浓缩物中去掉，将含有滤液的sCR1调整到适于随后进行的凝胶层析的pH值。第二步PHARMCIAS琼脂糖快流速层析以150cm/hr的流速(一直如此)将pH5.2的滤液装在用缓冲液A平衡过的PHARMCIA S琼脂糖凝胶柱上。以150cm/hr的流速用3-5个层容积的缓冲液A冲洗柱，之后用5-10个层容积的缓冲液B冲洗。用3-5个层容积的缓冲液C洗脱sCR-1。收集所有的洗脱峰值直到吸收度降到所观察到的最大吸收度的5％为止。sCR1洗脱物约为1.5-2个层容积。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液A平衡，以使注保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
S琼脂糖层析去掉大部分源于杂质(特殊蛋白)的细胞和介质，缓冲液C柱中的sCR1浓缩物洗脱物为下一步使用。第三步使用TOYOPEARL AF-CHELATE 650M的IMAC第一部分用铜装IMAC柱以及该柱的平衡将铜装于柱上的方法如下用3个柱容积的WFI冲洗柱之后，将6-8个柱容积的0.2％硫酸铜穿过此柱。当兰色明显遍及整层时停止装载，多余的铜从洗脱液中流出。然后用1-2个层容积的WFI冲洗该柱，之后用3-5个层容积的缓冲液C冲洗该柱。第二部分IMAC柱的装载、冲洗、洗脱及产生装载、平衡后，以150cm/hr(一直如此)的流速将S琼脂糖洗脱物加于IMAC柱上(参看第三步第一部分)。用3-5个层容积的缓冲液C以150cm/hr的流速冲洗柱，之后用5-10个层容积的缓冲液D冲洗。在用缓冲液D冲洗完成后，赶紧用3-5个容积的缓冲液C冲洗柱，以使pH恢复到8，否则在使用缓冲液E时将会出现明显的铜浸出。用3-5个层容积的缓冲液E洗脱sCR1，收集全部洗脱峰值直到吸收度降到所观察到的最大吸收度的5％为止，sCR-1洗脱物约为2个层容积。因为铜与0.5M NaOH洗涤剂不相容，所以用5个层容积的50mM EDTA将铜去掉。必须收集浓缩后的铜流出物，按照当地的规定对其进行适当的处理。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液C平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
IMAC层析去掉源于杂质(特殊蛋白和DNA)的细胞和介质。第四步用胍灭活病毒以及硫酸铵的加入第一部分加入胍(在2-8℃下进行)加入半个容积的冷的缓冲液，并连续搅拌10-15分钟，使冷的IMAC洗脱物经过胍的处理。加完缓冲液F后，经过液面下的移液管将溶液移入第二个器皿中，并放置6分钟。第二部分加入硫酸铵(在2-8℃下进行)立即用相同容积的冷缓冲液G稀释经第四步第一部分处理过的溶液，连接搅拌10-15分钟。所得的溶液含1.0M胍，含0.9M硫酸铵。在进行第五步之前，将此溶液在2-8℃下保存。
胍处理使病毒灭活，加入硫酸铵以制备供Toyopearl BUTYL层析使用的溶液。第五步TOYOPEARL BUTYL-650M层析(2-8℃下)先用缓冲液H平衡Toyopearl Butyl-650M柱，然后以150cm/hr的流速将从第4步得到的溶液装于柱上。缓冲液和柱在2-8℃下，这很关键。装完后，用3-5个层容积的缓冲液H冲洗柱，用缓冲液I洗脱结合的sCR1。sCR1洗脱物为1.5-3个层容积，用0.2N NaOH反萃取柱。在一个可测定的峰值下，碱洗洗脱出蛋白杂质，进行中和反应，保留为进一步测定。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液H平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。第六步在pH为11下使病毒失活并对流过滤加2.5M NaOH将丁基洗脱液的pH调到11。立即通过液面下的导管将溶液移入第二个器皿中，pH为11保持16分钟后，用2.5MHCl将pH调到9.0。在一个装有30kD MWCO低蛋白结合膜的切向流仪器(如Filtron Omega Series)中，经过pH11处理后的溶液与缓冲液J连续对流过滤。持续对流过滤直到有4-5个容积的溶液进入渗透器，残余物的传导率≤2mS/cm。
pH11处理使病毒灭活，对流过滤制备出用于DEAE层析的sCR1溶液。第七步TOYOPEARL DEAE-650S层析将从第6步中得到的溶液以150cm/hr的流速装于用缓冲液J平衡过的Toyopeal DEAE-650S柱。装完后用3-5个层容积的缓冲液J冲洗柱。用5个柱容积的线性梯度洗脱结合sCR1，开始为100％缓冲液J，然后为100％缓冲液K。收集整个洗脱峰直到吸收度降为所观察到的最大吸收度的20％为止。然后将峰尾的收集液转入另一个容器中。应该洗脱出1-2个层容积的sCR-1。用3个层容积的缓冲液L冲洗反萃取柱。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液J平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
DEAE层析可去掉蛋白质、DNA和潜在的病毒杂质。第8步TOYOPEARL HW-55F层析将DEAE洗脱液以20cm/hr的流速装于用缓冲液M平衡过的Toyopearl HW-55F柱。所装的容积应该小于等于整层容积的10％，所装的浓度应该小于等于5mg/ml。收集整个峰直到吸收度降为最大吸收度的10％。将峰尾的收集液装入另一个容器。如果需要重复注入，将峰的各部分集中起来。现在此物可用于最后的浓缩。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液M平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
排阻层析去掉了最后微量低分子蛋白杂质，并将sCR1转变为一种含有与最终缓冲液N制剂相容组分的溶液。第9步浓缩和最后的过滤用一个切向流超过滤装置将HW-55F洗脱液浓缩为5-6mg/ml，这个装置的大小适于最后所需的容积(如Pharmacia Minisette超过滤装置或Millipore CUF装置)，并且与Filtron Omega Series30kD或100kD MWCO膜相配。浓缩后，将此溶液与5个容积的缓冲液N连续地对流过滤。将此浓缩后的sCR-1通过一个微孔为0.2微米的Millipak过滤器过滤入无菌的容器中。缓冲液缓冲液A 20mM磷酸钠，60mM NaCl，pH5.2缓冲液B 20mM磷酸钠，100mM NaCl，pH6.0缓冲液C 100mM磷酸钠，500mM NaCl，pH8.0缓冲液D 100mM乙酸，1M HaCl，pH4.0缓冲液E 50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM NaCl，pH8.0缓冲液F 6M盐酸胍，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液G 1.8M硫酸铵，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液H 0.9M硫酸铵，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液I 100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液J 50mM Tris/Tris，HCl，pH9.0缓冲液K 50mM Tris/Tris，HCl，0.2M NaCl，pH9.0缓冲液L 50mM Tris/Tris，HCl，1.0M NaCl，pH9.0缓冲液M 10mM磷酸钠，0.9％w/v NaCl，pH7.0缓冲液N 16.3mM磷酸钾，2.5mM NaCl，2％(w/v)甘露糖醇，pH6.9溶液WFI2.5M氢氧化钠0.5M氢氧化钠0.2M氢氧化钠0.01M氢氧化钠2.5M盐酸1M乙酸0.2％(w/v)硫酸铜五水合物(CuSO4·5H2O)50mM乙二胺四乙酸的二钠或四钠盐(Na2EDTA或者Na4EDTA)。柱的参数
纯化表步骤容积 [sCR-1] 蛋白sCR-1总 …蛋白 累积回(L)(G/L) (G/L) 量(G) (G)收率(％)介质905 0.05 未检测出 46.2 未检测出 100SSFF洗脱物 45.70.952.4943.311.894IMAC洗脱物 43.41.001.8244.181.996Buryl洗脱物 21.62.102.2445.250.198DEAE洗脱物 10.04.083.9440.839.489HW-55F 21.71.681.6536.435.879洗脱物纯化的sCR-1 6.8 5.335.1836.335.379用HPLC测定的sCR-1用280nm的吸光度测定的蛋白质(ε＝1.10mLmg-1cm-1)
权利要求
1.一种从一个含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白的方法，将所述的混合物依次与一种阳离子层析支持剂、金属亲合层析支持剂、一种分子排阻层析支持剂相接触并从每个支持剂中选择性地洗脱出蛋白。
2.按照权利要求1所述的方法，其中受体从CR1、CR2、CR3和CR4中选择。
3.按照权利要求2所述的方法，其中受体是CR1及其片段。
4.按照权利要求3所述的方法，其中受体是一个CR1的可溶性片段。
5.按照权利要求4所述的方法，其中受体是TP10HD。
6.按照权利要求1所述的方法，其中阳离子层析支持剂选自于CM-23-、CM-32-、CM-52-纤维素；CM-和SP-交联葡聚糖，CM-和S-琼脂糖以及CM-650 S TOYOPEARL中，并且用加入一个缓冲过的盐溶液进行洗脱。
7.按照权利要求6所述的方法，其中支持剂是S-琼脂糖，盐是氯化钠。
8.按照权利要求6所述的方法，其中盐溶液是100mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH8.0。
9.按照权利要求1所述的方法，其中金属亲合支持剂选自于硅胶，琼脂糖以及聚乙烯异丁烯酸共聚物中。
10.按照权利要求9所述的方法，其中取代基从IDA和TED中选择。
11.按照权利要求10所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLAF-CHELATE 650M。
12.按照权利要求1所述的方法，其中金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一个咪唑盐缓冲液选择性洗脱补体受体。
13.按照权利要求12所述的方法，其中咪唑盐洗脱缓冲液由50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM氯化钠组成，pH为8.0。
14.按照权利要求1所述的方法，其中分子排阻层析剂从SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55-F中选择。
15.按照权利要求14所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLHW55-F并且洗脱液为10mM磷酸钠，0.9％(w/v)的氯化钠，pH为7。
16.一种从含有一种补体受体蛋白组分的细胞条件培养基中纯化这种补体受体蛋白的方法，对介质依次进行(a)阳离子交换层析，(b)固定的金属亲合层析，(c)疏水性相互作用层析，(d)阳离子交换层析，和(e)分子排阻层析。
17.按照权利要求16所述的方法，其中阳离子交换层析所使用的支持剂是CM-23-、CM-32-、CM-52-纤维素；CM-和SP-交联葡聚糖，CM-和S-琼脂糖以及CM-650 STOYOPEARL中的一种，并且通过一个缓冲过的盐溶液洗脱。
18.按照权利要求17所述的方法，其中支持剂是S-琼脂糖，盐是氯化钠。
19.按照权利要求18所述的方法，其中盐溶液是100mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH8.0。
20.按照权利要求17所述的方法，其中金属亲合支持剂是选自于硅胶，琼脂糖以及聚乙烯异丁烯酸共聚物中。
21.按照权利要求20所述的方法，其中取代基从IDA和TED中选择。
22.按照权利要求21所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLAF-CHELATE 650M。
23.按照权利要求16所述的方法，其中金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一个咪唑盐缓冲液选择性洗脱补体受体。
24.按照权利要求23所述的方法，其中咪唑盐洗脱缓冲液由50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM氯化钠组成，pH为8.0。
25.按照权利要求16所述的方法，其中疏水性相互作用层析支持剂选自于烷基C2-C8-琼脂糖、芳基琼脂糖、烷基硅胶、烷基-有机聚合物树脂中。
26.按照权利要求25所述的方法，其中支持剂选自于丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖以及丁基-、苯基-和醚-TOYOPEARL中。
27.按照权利要求26所述的方法，其中支持剂为丁基-TOYOPEARL。
28.按照权利要求20所述的方法，其中支持剂为丁基-TOYOPEARL并且用一个低浓度盐缓冲液选择性地洗脱蛋白。
29.按照权利要求28所述的方法，其中选择性地洗脱蛋白的缓冲液含100mM磷酸钠，pH7.0。
30.按照权利要求16所述的方法，其中阴离子交换层析所使用的支持剂是DEAE-纤维素，DEAE-，QAE-交联葡聚糖，DEAE-，Q-琼脂糖以及TOYOPEARL DEAE 650S中的一种。
31.按照权利要求30所述的方法，其中所说的支持剂为TOYOPEARL DEAE 650S。
32.按照权利要求16所述的方法，其中分子排阻层析所使用的支持剂是SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55F中的一种。
33.按照权利要求32所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLHW55F。
34.一种从一种细胞条件培养基中纯化一种补体受体蛋白的方法，包括(a)浓缩细胞条件培养基；(b)在一种阳离子层析支持剂上吸附补体受体蛋白；(c)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白；(d)在一种固定的金属亲合层析支持剂上洗脱冲洗后的蛋白；(e)吸附从步骤中洗脱后的蛋白；(f)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白；(g)洗脱冲洗后的蛋白；(h)在一种疏水性相互作用层析支持剂上吸附从步骤(g)中洗脱过的蛋白；(i)选择性地洗脱这种蛋白；(j)在一种阴离子交换支持剂上吸附从步骤(h)中洗脱过的蛋白；(k)洗脱吸附后的蛋白；(l)对来源于步骤(k)中的洗脱物进行分子排阻层析；(m)由此回收这种蛋白。
35.按照权利要求34所述的方法，包括能够如果存在的任何病毒灭活的步骤。
36.按照权利要求35所述的方法，其中所说的病毒灭活步骤在步骤(i)之后步骤(j)之前和/或在步骤(g)之后步骤(h)之前进行。
37.按照权利要求36所述的方法，其中所说的病毒灭活步骤包括用碱或盐酸胍对洗脱液进行处理。
38.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(b)的阳离子交换支持剂为磺酸盐取代的琼脂糖。
39.按照权利要求34所述的方法，其中固定的金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M。
40.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(j)的阴离子交换支持剂选自于二乙氨乙基，季氨基乙基和季铵取代的树脂，交联葡聚糖，琼脂糖或TOYOPEARL中。
41.按照权利要求40所述的方法，其中阴离子交换支持剂为二乙氨乙基取代的TOYOPEARL。
42.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(h)的疏水性相互作用层析剂选自于烷基C2-C8-琼脂糖、芳基-琼脂糖、烷基硅胶、烷基-有机聚合物树脂中。
43.按照权利要求42所述的方法，其中支持剂选自于丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖以及苯基-，醚-和丁基-TOYOPEARL中。
44.按照权利要求43所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARL650。
45.按照权利要求44所述的方法，其中分子排阻层析使用的是TOYOPEARL HW55F。
46.按照权利要求34所述的方法，其中所说的经过层析步骤(1)的蛋白用沉淀、浓缩和超过滤回收。
47.一种从一个含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白的方法，将所说的混合物吸附于一个固定金属亲合支持剂上，冲洗吸附后的蛋白，洗脱并且回收此蛋白。
48.按照权利要求47所述的方法，其特征在于在固定亲合层析支持剂吸附之前或之后，加入一步或多步蛋白纯化步骤。
全文摘要
本发明涉及固定的金属亲合层析法在补体受体蛋白纯化中的应用。
文档编号C07K14/715GK1130353SQ94193182
公开日1996年9月4日 申请日期1994年7月6日 优先权日1993年7月9日
发明者T·M·史密夫, G·福伦纳-瓦泽曼 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化领域。特别是，涉及应用固定的金属亲合层析技术纯化补体受体蛋白质。本发明的背景技术以往，纯化蛋白质的方法是由这种欲纯化蛋白质与废弃蛋白质杂质分子的大小、电荷和溶解性这些性能的不同所决定的。基于这些参数的方法包括分子排阻层析法、离子交换层析法和差示沉淀法等。
分子排阻层析法，也可以称做凝胶过滤层析法或凝胶渗透层析法，它的机理是流动相中的大分子渗透到固定相颗粒的孔隙中。渗透差是颗粒的流体动力学体积的函数。因而，在理想的条件下，当小分子进入到颗粒体内时大分子被排阻到颗粒外部。洗脱容积与分子量的对数呈线性关系，所以可以根据蛋白质的大小确定洗脱顺序。分子排阻层析法的支持剂主要为交联葡聚糖如SEPHADEX，珠状琼脂糖颗粒如SEPHAROSE(二者均可在瑞典Pharmacia AB.Uppsala买到)，交联聚丙烯酰胺如BIOGEL(可从加利弗尼亚，Richmond，BioRad药厂买到)，或乙二醇异丁烯酸共聚物如TOYOPEARL HW65S(可从日本东京ToyoSoda买到)。它们都可用于本发明的实施。
沉淀方法取决于在蛋白质粗混合物中各个蛋白质的溶解性可能存在的极大的不同。尽管蛋白质在水介质中的溶解性受多种因素影响，但为讨论起见，通常认为如果蛋白质与溶剂间的相互作用强于与相同的或类似的蛋白质分子间的相互作用则这种蛋白质为可溶性的。不局限于任何描述沉淀现象的特殊机制学说，有人认为蛋白质与水分子间的相互作用是通过氢与几种无电荷基团结合以及氢与带电荷基团静电结合为偶极而产生的，沉淀物如单价阳离子的盐(如硫酸铵)与蛋白质竞争水分子，因此，在高盐浓度下蛋白质“脱水”，与水之间的相互作用减弱，与相似蛋白质的聚集增加，导致从介质中沉淀出来。
离子交换层析法涉及样品中的带电官能团与带相反电荷的离子官能团在吸附表面的相互作用。已知有两种普通类型的相互作用。阴离子交换层析法是通过带负电荷的氨基酸支链(如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的吸附表面产生相互作用而完成的，阳离子交换层析法是通过带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸和精氨酸)与带负电荷的吸附表面产生相互作用而完成的。
最近开发的亲合层析技术和疏水性相互作用层析技术进一步补充了较为传统的分子排阻层析法和离子交换层析法。亲合层析的依据为蛋白质与一种固定配体间的相互作用。在这种配体为一种底物，底物类似物，抑制剂或抗体的情况下，它对于特殊蛋白质能是特异的。另一方面，这种配体还可以与大量的蛋白质发生反应。象一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟碱腺嘌呤二核苷酸或某种染料的常用配体均可用于回收一种特殊类型的蛋白质。这种亲和层析法中至少的生物特异性之一是固定的金属亲合层析技术(IMAC)也可以称作金属螯合层析法。Porath et al.，(Nature 258598-99(1975)中介绍的IMAC涉及将一种金属与一种固体支持剂螯合，然后与欲分离蛋白质表面的电子供体氨基酸残基形成一种复合物。
疏水性相互作用层析法的首次开发源于一种观察即蛋白质可在包含有碳氢化合物连接臂(spacer arm)但不含有亲合配体的亲合凝胶上保留。尽管在本领域中有时使用疏水性层析法的名称，但较好的名称为疏水性相互作用层析法(HIC)，因为这种溶液与凝胶之间的相互作用是疏水性过程而不是色谱分析过程。在高离子强度下疏水性相互作用非常强，因此，在盐沉淀或离子交换之后很容易完成这种形式的分离。通过改变溶剂、pH值、离子强度或者通过加入高离液序列或有机调节剂如乙二醇能够实现从HIC支持剂上的洗脱。有关疏水性相互作用层析法的基本原理的描述可以在美国专利3,917,527和美国专利4,000,098中看到。下列的公开的参考文献中举例说明了HIC在纯化特异性蛋白质中的应用人的生长激素(美国专利4,332,717)，毒素共轭物(美国专利4,771,128)，抗溶血因子(美国专利4,743,680)，瘤坏死性因子(美国专利4,894,439)，白细胞介素-2(美国专利4,908,434)，人的淋巴毒素(美国专利4,920,196)和溶菌酶种类(Fausnaugh，J.L.和F.E.Regnier，J.Chromatog.359131-146(1986)。
本发明是将离子交换法，IMAC，HIC和分子排阻层析法结合起来用于补体受体分子和补体受体相似分子的纯化。本发明的简单描述本发明涉及一种从含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括把该混合物依次与一种阳离子层析支持剂、金属亲合层析支持剂、分子排阻层析支持剂相接触并且选择性地从每一种支持剂中洗脱出这种蛋白质。
另一方面，本发明提供了从含有一种补体受体蛋白的细胞条件培养基中纯化这种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括对这种培养基进行依次处理(a)最初的阳离子交换层析，(b)固定的金属亲合层析，(c)疏水性相互作用层析，(d)阴离子交换层析，以及(e)排阻层析。
另一方面，本发明提供了从细胞的条件培养基中纯化一种补体受体蛋白质的方法，这种方法包括(a)浓缩细胞的条件培养基；(b)把补体受体蛋白质吸附在一种阳离子层析支持剂上；(c)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白质；(d)在一种固定的金属亲合层析支持剂上洗脱冲洗过的蛋白质；(e)吸附从(d)步骤中洗脱的蛋白质；(f)用至少一种缓冲液冲洗吸附的蛋白质；(g)洗脱冲洗过的蛋白质；(h)在一种疏水性相互作用层析支持剂上吸附从步骤(g)中洗脱过的蛋白质；(i)选择性地洗脱这种蛋白质；(j)在一种阴离子交换支持剂上吸附从步骤(h)中洗脱的蛋白质；(k)洗脱吸附的蛋白质；(l)对步骤(k)中的洗脱物进行分子排阻层析；(m)由此回收这种蛋白质。本发明的详细描述本发明涉及蛋白质的纯化技术，这种技术可应用于补体受体蛋白质的大规模纯化。因为它可以获得蛋白质纯度＞95％的受体蛋白质，所以特别有用。本发明还可以用于大量补体受体蛋白质及补体受体类似物蛋白质的纯化。
补体是一组血清蛋白，可被有限蛋白水解依次激活，是人体免疫的重要因子。补体的活性是由早期活性补体成分与抗原/抗体复合物相互作用而产生的。激活后的蛋白水解片段单独或与其它蛋白一起激活其它的补体成分，引起一种蛋白水解的连锁反应，此反应过程与凝血因子的活动相似。或者，通过细菌细胞壁成分，蛋白水解酶(如血纤维蛋白溶酶)或复合碳水化合物(如旋复花粉)激活补体。补体系统的成分能够调节许多生物活性作用(如免疫胞溶，过敏毒素的产生，溶菌作用，趋化作用，溶血作用，调理作用和吞噬作用)。
CR1-CR4为已知的四型补体受体(CR)。补体受体1(CR1)是补体成分C3b和C4b的受体，补体受体2(CR2)是补体成分C3dg或C3d的受体，补体受体3(CR3)是补体成分C3bi的受体，补体受体4(CR4)是补体成分C3dg的受体。
1型补体受体(CR1)存在于红细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、B细胞、某些T细胞、脾滤泡树突状细胞以及肾小球内的足状突细胞的细胞膜上。CR1连接C3b和C4b并称之为C3b/C4b受体。它的初级序列已经确定(Klickstein et al.，J.Exp.Med.1651095-1122(1987)，Klickstein et al.J.Exp.Med.1681699-1717(1988)，Hourcade et al.J.Exp.Med.1681255-1270(1988)。它是由30个含60-70个氨基酸的短concensus repeats(SCR)组成，其中保存有29个SCR，每个SCR平均含有65个氨基酸。有人认为每个SCR通过二硫键形成一个三元三维环状结构，这种结构是以二硫键把第三和第一和第四和第二个半胱氨酸连接形成的。这些SCRs进一步组成4个长类似复制(homologous repeats)(LHR)，每个LHR由7个SCRs组成在顶枝序列之后，该分子由含有一个C4b连接区的多个N端的LHR-A，接着是两个重复片段，含有3b连接区的LHR-B和LHR-C以及多个C端的LHR-D组成，随后有2个附加的SCRs，一个是含有25个残基的公认转换膜区域和一个43个残基的细胞浆末端。
CR1是具有SCR同系现象总族中的一员。这个总族包括具有一种C3/C4结合功能的成员，如CR2，C4bp，H因子，B因子和C2，还包括没有此功能的蛋白质，如白介素-2受体，b2-糖蛋白I，Clr，结合珠蛋白的一条链以及XIIIb因子。
CR1已知为一种糖蛋白，推测其氨基酸序列具有24个位点，此位点用来结合胞外区域的N-联寡糖。但是，衣霉素条件下的CR1合成(Lublin et al.J.Biol.Chem.2615736(1986))和氨基葡糖内容物的分析(Sim，Biochem J.232883(1985))推测实际只有6-8个位点用于联接寡糖。糖蛋白的N-端似乎被封闭。
CR1存在四种不同的同种异型，其区别在于大小按30-50kD增加。在人群中这些同种异型的基因频率不同(Holter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842459-2463(1987))。F(或A)型同种异型由4个LHR组成，其大小约为250kD；较大的S(或B)型同种异型含有第5个LHR，它是一个LHR-B5′端的一半和LHR-A3′端的一半的嵌合体，可推测出它有一个C3b的第三结合位点(Wong et al.J.Exp.Med.169847(1989))，其大小约为290kD。最小的F′(或C)型同种异型在全身性红斑狼疮(SLE)病人中发生率较高(Van Dyne et al.，Clin.Exp.Immunol.68570(1987)和Dykman et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 801698(1983))，这很可能是由LHR-B和一个C3b结合位点的缺失所引起的。
在正常人和具有SLE的某些病人的血浆中已经发现一种天然可溶型CR1(Yoon & Fearon J.Immunol.1343332-3338(1985))。在结构和功能上它们的特征与那些红细胞(细胞表面)的CR1的都很相似。
Hourcade等(J.Exp.Med.1681255-1270(1988)还在人的CR1转录单位上观察到一个可替代的多腺苷酰化位点，可推测出这个转录单位可产生一种分泌型CR1。这个截断序列所产生的mRNA包括第一位的8.5个SCR；如C4b结合区，并能够编码一种约80kD的蛋白质。当把一个与此截断序列相应的cDNA转染入COS细胞并且表达时，表现出所期望的C4b结合活性，而非C3b结合活性(Kyrch et al.F.A.S.E.B.J.3A368(1989)。Krych等还观察到一种与几种人体细胞系中推测的相似的mRNA，并推断在人体中能合成这种能够结合C4b的可溶型CR1截断序列。
借助重组DNA的方法从被表达出的DNAs中删除转换膜区域也可以产生一些可溶性CR1片段(Fearon等国际专利公开号WO 89/09220，1989年10月5日公开以及Fearon等的国际专利公开号WO 91/05047，1991年4月18日公开)。这些可溶性CR1片段具有活性功能，它们能够结合C3b和/或C4b，并表现出I因子辅助因子的活性，这些活性依它们所包含的区域而定。另外它们能够作为CR1的功能如中性粒细胞氧化破裂，补体介导溶血以及C3a和C5a的产生的体外抑制剂。一种由质粒sCR1/pBSCR1c编码的可溶性CR1结构还在体内的反向被动阿图斯反应中表现出活性(Feuron et al.1989 & 1991以及Yeh etal.J.Immunol(1991))，并且能抑制分泌物潴留后的心肌炎症和坏死(Fearon et al.1989 & 1990以及Weisman et al.，Science 249146-151(1990))。再者，SCR1/pBSCR1c产物与对甲氧苯酰化的人纤维蛋白溶酶原-链激酶-激活性复合物(APSAC)的共同制剂具有与单独的APSAC相似的抗溶血活性，这表明将这种补体抑制剂SCR与一种溶栓剂组合是一种有用的联合治疗(Fearon等，国际专利公开号WO 91/0504
公开日1991，4，18)。
补体受体类似蛋白质是指可以用本文所描述的方法可纯化的蛋白质，如果需要该方法可以通过常规的非发明性的调整进行改良，并不需要做太多的实验。这类蛋白质包括多个CR的同种异型和等位基因，截断类型，化学修饰类型如经过PEG处理的以及含有一个CR部分的核聚变蛋白质。这些蛋白质称为补体受体类似物，因为它们具有或保留了CR蛋白质的特性，足可以用本发明的方法纯化。除非有特殊限定，补体受体蛋白质术语还包括补体受体类似蛋白质。CR-1类似蛋白质代表CR-类似蛋白质的一个亚型，它包括来源于CR-1的同种异型的等位基因、截断类型、化学修饰类型以及核聚变蛋白质。可溶性补体受体1(sCR1)，本文中被认为是含有全部30个细胞外SCR区的人CR1的一种可溶性类型，它是CR-1类似蛋白质中的一个特例。
用各种技术能够制造出本发明的补体受体蛋白质。如果需要完整的天然链，可以从上面确定的细胞来源中提取天然分子。如果需要的是可溶性类型，优选天然完整分子的片段。因而，编码所需链片段的DNAs被表达为重组方式产生的蛋白质片段。本发明对从各种可以产生sCR1重组细胞系的细胞条件培养基中纯化sCR1特别有用。虽然可以在本文公开的内容基础上，想到细胞系以及补体受体产物的某些变化，但是调整本发明以适应一个补体受体蛋白质和所产生的细胞系的特别组合，却在本领域普通技术人员所能想到的范围之内。
通常，编码蛋白质如补体受体的基因是通过把编码所需多肽区域的DNA片段并入到一个重组DNA载体(如媒介动物)中，并且转化或转染适宜的原核生物或真核生物宿主来克隆的。适宜的原核生物宿主包括但并不局限于Escberichia，Streptomyces，Bacillus等等。适宜的真核生物宿主包括但并不局限于酵母菌，如Saccharomyces以及培养基中的动物细胞如VERO，Hela，小鼠C127，中国大田鼠卵巢(CHO)，WI-38，BHK，COS，MDCK，和昆虫细胞系。特别优选的宿主为缺乏二氢叶酸还原酶的CHO细胞系如ATCC CRL 1793，CRL 9096以及如下所述的其它细胞系。现在这种重组技术已经众所周知并且在Methods in Enzymdoog(Academic Press)，卷65和69(1979)，100和101(1983)中有所描述，其中还列举了参考文献。在Maniatis等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)和Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing(1988，1991)中可以找到使最常用的重组DNA整套方法的许多技术讨论。
把cDNA克隆化是获得一个可以编码一个所需多肽如一个补体受体的DNA片段的方法之一。在此过程中，可以将信使RNA(mRNA)从已知或推测能够产生所需蛋白质的细胞中分离出来。通过一系列的酶催化反应，把细胞的mRNA群复制到一条互补DNA(cDNA)中。然后将所得cDNA植入克隆载体，之后用于转化一个适宜的原核生物或真核生物宿主。所得cDNA“文库”是由一群转化后的宿主细胞组成，每个宿主细胞含有一个基因单体或一个基因片段。从理论上讲，这个全部文库提供了一个具有代表性的编码信息样本，其存在于用作起始物质的mRNA混合物中。
使用核酸或抗体探子筛选这些文库以便确定特殊的DNA序列。一旦分离出来，这些DNA序列可以被修饰或者装配成完整基因。或者，正如本发明所述，基因的特异性片段可以不依赖于这个基因的其它部分而独立装配。尽管由这些装配后的基因片段编码的蛋白质片段不能在自然界中发现，但是它们在治疗不希望的生理疾病方面却有重要用途。能够用于预防和/或治疗与补体活性有关的序列的紊乱的可溶性补体受体的遗传工程学就是其中的一例。
基因或基因片段一经克隆化，DNA就可以转入一个表达载体，这种结构可以用于转化一个适宜的宿主细胞。表达载体是以具有如本文所定义的表达控制序列为特征的，所以当一个有关的DNA序列有效地联接到载体上时，这个载体就能够控制产生一种产物，这种产物是由与含有这个载体的宿主细胞有关的DNA序列编码的。与本发明特别有关的是一旦形成表达一种可溶性受体蛋白，装配这种单克隆序列的片段也就成为可能。这种方法在SCR1重组生产上的特别有效的应用可见上文援引过的Fearon等的PCT申请WO 89/09220，1989年10月5日公开以及WO 91/05047，1991年4月18日公开的文献。
产生重组产物之后需要将其分离出来。如果这个产物是由产生它的细胞运送的，那么可以直接从细胞培养中将其分离出来。如果这个产物仍留在细胞内，那么必须通过机械、化学或生物的方法完全地破坏细胞以获得这个细胞内产物。
如果是一种蛋白质产品，这种纯化方法不仅能提供一种基本上不含其它蛋白质的产品，也就是说在制剂中这种蛋白质在总蛋白中的纯度至少为80％，最好大于95％，而且还要除去其它宿主细胞杂质，DNA，RNA，潜在热原等等，或者将它们降低为可接受的水平。
如上所述，多种宿主细胞均可用作生产本发明的受体。首先考虑到受体的性质，合成率，衰败率以及能够引发这种受体表达的重组载体的特性诸方面，选择一个特殊的宿主细胞在普通技术人员的能力范围之内。所选择的宿主细胞表达系统在很大程度上决定着所使用的细胞培养方法的性质。一旦选择了表达系统，也就选择了一种一次性或连续性，螺旋式或空气式提升的，流动性或固定性生产模式。因而，可以使用流动层生物反应器，空心丝生物反应器，滚动式培养瓶，或者搅拌釜生物反应器，可以有也可以没有细胞微载体。这种选择的标准在细胞培养领域中是可以想到的。因为这不属于本发明的范畴，所以不在此详述。本发明涉及存在于一个可调节的细胞培养基中的补体受体的纯化。
如上所述，本发明涉及固定的金属亲合层析(IMAC)在补体受体蛋白质纯化中的应用。IMAC的原理是通常可想到的。人们认为在一个金属离子与位于所要结合的蛋白质的表面可接近的电子给体氨基酸之间形成一种金属配位化合物来决定吸附的，该金属离子是由吸附基质上的螯合作用固定的氨基酸。金属离子微包绕物包括并不局限于基质，隔离杆(即使有也极少)，螯合配体，金属离子。普通技术人员能够控制周围的流动培养基和溶解状态的可溶性品种的特性以改变所需的分离等级。
并非局限于任何特殊的机制理论，人们进一步认为就结合而言较重要的氨基酸残基为组氨酸、色氨酸、也可能为半胱氨酸。如果在蛋白质中找到一个或多个这种残基，就可以推测所有蛋白质与IMAC柱结合。尽管如此，对发生有效结合来说，这种残基不仅必需存在而且还应当是可以接近的(如位于蛋白质的表面)。最后，本发明还考虑到其它适于补体受体蛋白的残基。通过美国专利4,569,794中所描述的下列的方法将残基装配进本文所述的重组表达系统中，如加到蛋白质的氨基端或羧基端的聚组氨酸尾部。
金属的性质以及在柱上的配位方式也可以影响这种结合反应的强度和选择性。硅胶基质，琼脂糖以及有机合成分子如聚乙烯异丁烯酸共聚物均可使用。这种基质最好含有促进螯合的取代基。可以使用象亚氨基二乙酸(IDA)或它的三(羧基甲基)亚乙基二酰胺(TED)的取代基。IDA为优选。一种特别有用的IMAC物质为Toyopearl AF-Chelate 650M，它是一种用IDA取代的聚乙烯异丁烯酸共聚物。虽然Co 、Ni 、Cd 和Fe 均可使用，但优选到锌为止的第一过渡系元素中的二价金属。当然，一个重要的选择参数是此金属与欲纯化蛋白的亲合力，Cu 为优选。在这些金属离子周围的四个配位位置中，至少有一个被一个水分子占用，这个水分子在弱碱性pH下容易被一个较强的电子给体如一个组氨酸残基取代。
在实践中，用金属盐浓溶液脉冲给IMAC柱装上金属然后用水或缓冲液过柱。该柱常常显示出金属离子的颜色(锌除外)。通常，金属数量的选择以大约能够装满柱的一半为准，这使金属离子能够缓慢地滴入未装区域而不会进入洗脱液中。在此之前通常用欲洗脱缓冲液进行预冲洗。为了使非特异性离子交换作用降低到最小，样品缓冲液应该含到1M或更多的盐。在较高pH的情况下蛋白的吸附作用达到最大。洗脱通常是通过降低pH值以使被吸附蛋白上的供电子原子团质子化，或者是通过在pH9条件下利用较强的配位剂如咪唑或甘氨酸。在后种情况下，可以从柱中置换金属。使用线性梯度洗脱方法也有很大益处。
如上所述，IMAC是一种特别适用于结合有其它蛋白质物质的纯化技术。也就是说，将IMAC用于已经用其它蛋白纯化方法部分纯化后的物质更为适合。“部分纯化的”一词的含义是一种蛋白制剂，其中有益蛋白质的重量百分比至少为5％，至少10％较好，至少45％更好。因而，在上下文中对IMAC的应用大加推崇，因为它是一种能完全纯化补体受体蛋白的方法。美国专利申请流水号第857,002，1992年3月24日公开的文献公开了一种特别有用的联合层析方法，此处将其引用为参考文献。例如，在使用IMAC之前使一个细胞条件培养基样本接受部分纯化，这已经被发现很有益处的“细胞条件培养基”一词的含义是一种支持细胞生长和/或细胞修复的细胞培养基，它含有分泌产物。在使用IMAC步骤之前先对此培养物的浓缩样本进行一步或多步蛋白纯化。可以将对样本进行离子交换层析作为第一步。如上所述，可以将多种阴离子或阳离子取代基加在基质上以形成层析用阴离子或阳离子支持剂。阴离子交换替代物包括二乙基氨基乙基(DEAE)，季铵乙基(QAE)以及季胺(Q)基团。阳离子交换替代物包括羧基甲基(CM)，磺乙基(SE)，磺丙基(SP)，磷酸盐(P)以及磺酸盐(S)。纤维素离子交换树脂如DE23，DE32，DE52，CM-23，CM-32以及CM-52均可从Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.中得到以SEPHADEX为主，而交联离子交换剂也是已知的。如DEAE-，QAE-，CM-，和SP-SEPHADEX以及DEAE-，Q-，CM-和S-SEPHAROSE均可从Pharmacia AB中得到。而且，来源于乙二醇异丁烯酸共聚物的DEAE和CM，如TOYOPEAPL DEAE-650S和TOYOPEARL CM-650S均可从Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa中得到。因为来源于离子支持剂的洗脱通常包括加盐，而且在增高的盐浓度下会增强如前所述的IMAC，所以在经过离子交换层析步骤或其它盐介导的纯化步骤之后进行IMAC步骤为优选方案。其它纯化方法也可以加入，包括并不局限于HIC，进一步离子交换层析，分子排阻层析，病毒灭活，浓缩和冷冻干燥。
在水溶剂中疏水性分子将会自身缔合。这种缔合是由于疏水性相互作用而产生的。现在认为大分子如蛋白质除具有能够推测的疏水性基因外，还在其表面存在大量疏水性碎片。HIC部分是由这些碎片与附着与层析支持剂上的疏水性配位体的相互作用产生的。一种与一个基质结合的疏水性配位体本文也可以称为HIC支持剂，HIC凝胶或HIC柱。进一步认为蛋白与HIC支持剂之间的相互作用的强弱不仅是蛋白质上非极性和极性表面的均衡的作用，而且还与非极性表面的分布有关。
许多基质均可用于HIC柱的制备，其中应用最多的是琼脂糖。硅和有机聚合物树脂均可使用。可用的疏水性配位体包括并不局限于含有2-10个碳原子的烷基基团，如丁基、丙基或辛基；或者为芳基如苯基。用于凝胶和柱的常规HIC产品可以从市场上的商品中得到，如Pharmacia LKB AB，Uppsala，瑞典生产的商品名为丁基-SEPHAROSE，苯基-SEPHAROSECL-48，辛基-SEPHAROSEFF以及苯基-SEPHAROSEFF的商品；日本东京Tosoh公司生产的名为TOYOPEARL丁基-650，乙醚-650或苯基-650(Fractogel Tsk丁基-650)或TSK-GEL苯基-5PW的商品；Miles-Yeda，Rohovot，以色列生产的名为烷基琼脂糖的商品，其中烷基含有2-10个碳原子，以及J.T.Baker，Philipsburg，N.J.生产的名为BakerbondWP-HI-丙基的商品。
配位体浓度是一个不仅影响相互作用的强度而且影响柱的层析能力的重要参数。市场上可以得到的苯基、辛基苯基凝胶的配位体浓度为每毫升凝胶层含有40微摩尔凝胶。凝胶的层析能力是正被谈论的特定蛋白以及pH、温度和盐浓度的函数，但是，人们常希望它能落在3-20mg/ml的范围内。
本领域的普通技术人员能选择一种特殊的凝胶。通常，蛋白与HIC配位体间的相互作用力的强弱随着烷基配位体的链的长度的增加而增加，但是对大多数分离来讲，含有4-8个碳原子的配位体较为适宜。尽管由于苯基与蛋白质上的芳基间的pi-pi相互作用的可能性这种选择性有很大不同，但是苯基和戊基却具有相同的疏水性。
虽然，蛋白质与HIC柱的吸附作用在高盐浓度下较好，但是准确的浓度却可以根据此蛋白与所选用的HIC配位体的性质在一个较大的范围内变化。可以根据它们是否能促进疏水性相互作用(盐析效应)或破坏水的结构(离液效应)在一个被称为憎溶系中选择离子并且能导致疏水性相互作用减弱。在盐析效应增强方面，阳离子的排列顺序为Ba ＜Ca ＜Mg ＜Li ＜Cs ＜Na ＜K ＜Rb ＜NH4 。而在离液效应增强方面，阴离子的排列顺序为PO---＜SO4--＜CH3COO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。
因而，将影响相互作用强弱的盐用下列关系式给出它们的关系Na2SO4＞NaCl＞(NH4)2SO4＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN通常使用的盐浓度为硫酸铵约0.75-2M，NaCl约1-4M。
虽然温度的下降可引起相互作用的减弱，但是温度对HIC分离的影响却很复杂。不管怎样应该加大任何有利因素以对抗如在蛋白活动中产生的相反作用的增强，这些有利因素是随着温度的增加而增强的。
无论是分步洗脱还是梯度洗脱均可用许多方法完成(a)通过改变盐的浓度，(b)通过改变溶剂的极性，(c)通过加入洗涤剂，通过降低盐浓度以疏水性作用增加的顺序洗脱被吸附的蛋白。通过加入如乙二醇或(异)丙醇的溶剂由此减弱疏水性相互作用，以改变溶剂的极性。洗涤剂的作用为置换蛋白，主要用于有关膜蛋白的纯化。
当对经过HIC的洗脱物进行进一步的离子交换层析时，阴离子方法和阳离子方法均可使用。
如上所述，凝胶过滤层析是对基于分子大小的分离起作用，它是以筛选分子的形式起作用的。人们希望基质与所存在的溶质之间无相互作用，因而可优选所有的惰性基质。人们还希望基质硬而且为大孔。大规模生产时，其硬度尤为重要，因为这个参数与最终的流速确定有很大关系。传统的物质如SEPHADEX或BIOGEL虽有足够的惰性且孔的大小符合要求，但这些凝胶相对较软而且尤其不适合大规模的纯化。最近开发了一些硬度增加的凝胶(如SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL和SUPEROSE)。所有这些基质产品的颗粒大小小于那些可得到的传统支持剂，从而即使在较高流速下仍保持再溶解。优选TOYOPEARL HW系列基质(Toso Haas)。
本发明可用于溶解型补体受体的纯化仅仅是为了详细说明本发明的目的。具体地说是将其应用于一个最多包含前导链，LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30区域并包括转换膜区域的第一丙氨酸残基的可溶性CR1结构，这与Fearon等；1989，国际专利公开号WO 89/09220，
公开日1989年10月5日文献中描述的用于质粒pBSCR1c中CR1编码序列相一致(此后称为“TP10HD”)。这种TP10HD产品的重组系统的结构在上述的PCT申请中有详细描述，总结如下。
用胰蛋白酶处理CHO细胞，在平皿中培养出一个每60mm 5×105的盘，放入生长培养基中，在37℃，5％CO2/P5空气的气压下，在可调湿的孵化器中培养(这种生长培养基为Hams F12营养培养基(041-1765)，含1％普通的谷氨酸(043-05030)、1％普通的pen/strep(043-05070)以及10％小牛血清(011-6290)，Gibco，Paisley，苏格兰生产)。21小时后将此细胞用于DNA转染。用pSV2dhfr将一个来源于pBSCR1c含有sCR1编码序列的表达质粒一起转染入一个需要dhfr的中国Hamster Ovary细胞系(CHODUXBII)。转染在生长培养基中进行，并且使用了如DNA Cloning，D.M.Glover ed.(Chap.15，C.Corman)中所述的钙共同沉淀或甘油冲击方法。在用pBSCR1c/pTCSgpt和pSV2dhfr转染之后，开始选择之前，将细胞在生长条件下(如上所述在生长培养基中继续保存46小时。
选择和共同增强的进行基本如R.J.Kaufman，等(Mol.Cell.Biol 51750-1759(1985)所述。转染后46小时细胞变为选择性培养基MEM ALPHA(041-02571)，它含有1％普通谷氨酸、1％普通pen/strep(043-05070)以及经过渗析的胎牛血清(220-6300AJ)(Gibco，Paisley，苏格兰生产)。将细胞在选择性培养基中保存8-10天直到dhfr 克隆出现，当建起克隆时，细胞变为含有氨甲蝶呤的选择性培养基(A6770，Sigma Chem.Co，St.Louis，Mo.)。氨甲蝶呤的浓度开始为0.02μM，以后逐步增加到5μM。在放大过程中用来源于生长细胞的生长培养基的等分试样测定ELISA生产的TP10HD。按照本发明，任何能分泌重组细胞系(如ATCC CRL10052)的补体受体均可用来提供纯化用的条件培养基，当然不需要一个特别的细胞系。
培养一个能够产生TP10HD的转染CHO细胞系可以采用多种细胞培养技术。对本发明的应用而言，培养的特殊方法并不是重要的，但为了详细说明的目的，可用的细胞培养的一种方法是一种连续灌注法，此方法基于如美国专利4,861,714；4,863,856；4,978,616以及4,997,753中所载的Verax流动层技术。其内容本文引用为参考文献。因而，如上所述的转染细胞在用10％胎牛血清(FBS)和5mM氨甲蝶呤(MTX)补充的CCM-3培养基中递增，CCM-3培养基为DMEM，Ham′s F-12，牛血清白蛋白和其它营养性添加剂的混合物。在辊式瓶中扩大细胞群落直到产生足够的细胞以用于孵化一个生物反应器。
在孵化一个S200生物反应器之前进行器皿的清洁和蒸气消毒环节。然后用含有5％FBS的CCM-3填充并加入450g微球体。在孵化之前用培养基调节微球体。用细胞孵化此反应器，其操作参数为pH7.2，37℃，进口含氧100-400torr(进口是指流动层的底部)，出口含氧0-200torr(出口是指流动层的顶部)。继初相之后，进行培养基灌注，灌注率逐渐增加以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。如此连接灌注直到在反应器中积累了足够量的细胞以孵化一个S2000生物反应器。CTP和SIP之后，将加有5％FBS和5mM MTX的CCM-3培养基装入S-2000反应器中，并且加入5000g微球体。在孵化之前用培养基湿润此微球体。温度、反应设计和含氧量方面的操作条件如上所述。将S-200反应器中的微球体无菌地转入S-2000反应器以建立初相。当葡萄糖的浓度下降到1.5g/L以下时，通过一定流速的介质(CCM-3，5％FBS和5mM MTX)灌注启动生长相以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。通过测氧摄入率和葡萄糖消耗率来用曲线监测细胞的生长。当反应器的细胞积累到足够的数量时，灌注的培养基改为加有1％FBS和5mM MTX的CCM-3的一种过渡培养基。再次增加灌注率以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。在过渡性培养基中进一步生长之后，将灌注培养基再改为生产培养基，加有5mM MTX的CCM-3。增加灌注率以保持葡萄糖的浓度为1.0g/L。此后降低给定的出口含氧量或者循环流率以结束反应器的反应。生产相一般持续60天左右。
将400-1600升4-8℃下保存的的反应渗透剂穿过一个Millipore Prostak微过滤装置。对从此操作中得到的细胞外渗透剂进行超过滤。用Millipore Spiral Mound装置将渗透剂浓缩30-60倍。浓缩后，将残余物排入一个收集箱中，并将5-20L pH为7.5的50mM磷酸缓冲液装入该系统中。从系统中排出冲洗缓冲液并与残余物结合。将超过滤浓缩液通过一个预过滤器和一个终端为0.22mm的过滤器，滤入一个预先高压灭菌的Nalgene瓶中。通常每瓶装浓缩液800ml，冷冻保存。
如前所述，这种特殊的重组生产系统和细胞培养方法不在本发明范围内。上面讨论的系统和方法是本领域普通技术人员所能使用的许多方案中具有代表性的，本文包括它们仅为了详细说明发明目的。例如，从搅拌釜反应器中得到的介质同样适合作为用于本发明的条件培养基的来源物。本发明的主题是对纯化方法作常规修改，将其用多种重组补体受体蛋白和补体受体类似蛋白的纯化，与怎样生产或培养的这些蛋白无关。
应用本发明的方法所获得的纯化补体受体蛋白具有以下特性1)CR蛋白大于95％重量百分比；2)在4℃下蛋白分解作用可保持稳定至少三个月；3)低内毒素(每mg蛋白＜1E.U.)；4)低DNA(每mg蛋白＜1pg)；5)非CR蛋白小于5％；6)病毒灭活。
下列实施例用来进一步说明本发明，并不作为对权利要求的限制。
实施例I内容介绍下面概括的方法可以用于从细胞条件培养基浓缩物中分离和纯化可溶性补体受体-1(sCR1)。设计此方法为当去掉来源于宿主细胞、细胞培养基或其它原料的杂质时可以制备出蛋白纯度大于95％的sCR1。此回收方法由九步组成，其中包括阳离子和阴离子交换、固定的金属亲合、疏水性相互作用和分子排阻层析，以及二种病毒灭活处理。每一步详细描述如下，包括原料、方法和所期望的结果。1至3步在2-8℃下完成，6-9步在18-25℃下完成。所有的缓冲液在使用之前均用WFI调制并且经过一个10,000 MWCO过滤器的过滤。通过柱上显示的280nm紫外吸光度和传导性调节所有柱。在使用前洁净并平衡柱，每次使用后用NaOH洁净并在其中保存。
将此方法规模化以适应含有100G粗sCR1的近1000L培养基的需要，完成此套方法需7-14天，具体根据生产规模而定。第一步介质的预处理边搅拌边以1-3L/min的速度加入1M乙酸，使1000L细胞外条件培养基的pH值下降到5.2。所需乙酸的体积约为介质体积的3％，需要加15-30分钟。此后不断监测pH值。pH值的调节会产生大量沉淀。经过两串联(0.5微米)的Millipore 30英寸Polygard-CR过滤器微过量而澄清。在滤液中回收sCR1，当滤液积累到50-100L时开始第二步。可使过滤和装载同时进行。
将非sCR1蛋白和非蛋白类物质从酸化和过滤的介质浓缩物中去掉，将含有滤液的sCR1调整到适于随后进行的凝胶层析的pH值。第二步PHARMCIAS琼脂糖快流速层析以150cm/hr的流速(一直如此)将pH5.2的滤液装在用缓冲液A平衡过的PHARMCIA S琼脂糖凝胶柱上。以150cm/hr的流速用3-5个层容积的缓冲液A冲洗柱，之后用5-10个层容积的缓冲液B冲洗。用3-5个层容积的缓冲液C洗脱sCR-1。收集所有的洗脱峰值直到吸收度降到所观察到的最大吸收度的5％为止。sCR1洗脱物约为1.5-2个层容积。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液A平衡，以使注保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
S琼脂糖层析去掉大部分源于杂质(特殊蛋白)的细胞和介质，缓冲液C柱中的sCR1浓缩物洗脱物为下一步使用。第三步使用TOYOPEARL AF-CHELATE 650M的IMAC第一部分用铜装IMAC柱以及该柱的平衡将铜装于柱上的方法如下用3个柱容积的WFI冲洗柱之后，将6-8个柱容积的0.2％硫酸铜穿过此柱。当兰色明显遍及整层时停止装载，多余的铜从洗脱液中流出。然后用1-2个层容积的WFI冲洗该柱，之后用3-5个层容积的缓冲液C冲洗该柱。第二部分IMAC柱的装载、冲洗、洗脱及产生装载、平衡后，以150cm/hr(一直如此)的流速将S琼脂糖洗脱物加于IMAC柱上(参看第三步第一部分)。用3-5个层容积的缓冲液C以150cm/hr的流速冲洗柱，之后用5-10个层容积的缓冲液D冲洗。在用缓冲液D冲洗完成后，赶紧用3-5个容积的缓冲液C冲洗柱，以使pH恢复到8，否则在使用缓冲液E时将会出现明显的铜浸出。用3-5个层容积的缓冲液E洗脱sCR1，收集全部洗脱峰值直到吸收度降到所观察到的最大吸收度的5％为止，sCR-1洗脱物约为2个层容积。因为铜与0.5M NaOH洗涤剂不相容，所以用5个层容积的50mM EDTA将铜去掉。必须收集浓缩后的铜流出物，按照当地的规定对其进行适当的处理。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液C平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
IMAC层析去掉源于杂质(特殊蛋白和DNA)的细胞和介质。第四步用胍灭活病毒以及硫酸铵的加入第一部分加入胍(在2-8℃下进行)加入半个容积的冷的缓冲液，并连续搅拌10-15分钟，使冷的IMAC洗脱物经过胍的处理。加完缓冲液F后，经过液面下的移液管将溶液移入第二个器皿中，并放置6分钟。第二部分加入硫酸铵(在2-8℃下进行)立即用相同容积的冷缓冲液G稀释经第四步第一部分处理过的溶液，连接搅拌10-15分钟。所得的溶液含1.0M胍，含0.9M硫酸铵。在进行第五步之前，将此溶液在2-8℃下保存。
胍处理使病毒灭活，加入硫酸铵以制备供Toyopearl BUTYL层析使用的溶液。第五步TOYOPEARL BUTYL-650M层析(2-8℃下)先用缓冲液H平衡Toyopearl Butyl-650M柱，然后以150cm/hr的流速将从第4步得到的溶液装于柱上。缓冲液和柱在2-8℃下，这很关键。装完后，用3-5个层容积的缓冲液H冲洗柱，用缓冲液I洗脱结合的sCR1。sCR1洗脱物为1.5-3个层容积，用0.2N NaOH反萃取柱。在一个可测定的峰值下，碱洗洗脱出蛋白杂质，进行中和反应，保留为进一步测定。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液H平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。第六步在pH为11下使病毒失活并对流过滤加2.5M NaOH将丁基洗脱液的pH调到11。立即通过液面下的导管将溶液移入第二个器皿中，pH为11保持16分钟后，用2.5MHCl将pH调到9.0。在一个装有30kD MWCO低蛋白结合膜的切向流仪器(如Filtron Omega Series)中，经过pH11处理后的溶液与缓冲液J连续对流过滤。持续对流过滤直到有4-5个容积的溶液进入渗透器，残余物的传导率≤2mS/cm。
pH11处理使病毒灭活，对流过滤制备出用于DEAE层析的sCR1溶液。第七步TOYOPEARL DEAE-650S层析将从第6步中得到的溶液以150cm/hr的流速装于用缓冲液J平衡过的Toyopeal DEAE-650S柱。装完后用3-5个层容积的缓冲液J冲洗柱。用5个柱容积的线性梯度洗脱结合sCR1，开始为100％缓冲液J，然后为100％缓冲液K。收集整个洗脱峰直到吸收度降为所观察到的最大吸收度的20％为止。然后将峰尾的收集液转入另一个容器中。应该洗脱出1-2个层容积的sCR-1。用3个层容积的缓冲液L冲洗反萃取柱。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液J平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
DEAE层析可去掉蛋白质、DNA和潜在的病毒杂质。第8步TOYOPEARL HW-55F层析将DEAE洗脱液以20cm/hr的流速装于用缓冲液M平衡过的Toyopearl HW-55F柱。所装的容积应该小于等于整层容积的10％，所装的浓度应该小于等于5mg/ml。收集整个峰直到吸收度降为最大吸收度的10％。将峰尾的收集液装入另一个容器。如果需要重复注入，将峰的各部分集中起来。现在此物可用于最后的浓缩。
用0.5N NaOH处理至少1小时后用WFI冲洗并用缓冲液M平衡，以使柱保持干净并能重复使用。不用时将柱保存于0.01N NaOH中。
排阻层析去掉了最后微量低分子蛋白杂质，并将sCR1转变为一种含有与最终缓冲液N制剂相容组分的溶液。第9步浓缩和最后的过滤用一个切向流超过滤装置将HW-55F洗脱液浓缩为5-6mg/ml，这个装置的大小适于最后所需的容积(如Pharmacia Minisette超过滤装置或Millipore CUF装置)，并且与Filtron Omega Series30kD或100kD MWCO膜相配。浓缩后，将此溶液与5个容积的缓冲液N连续地对流过滤。将此浓缩后的sCR-1通过一个微孔为0.2微米的Millipak过滤器过滤入无菌的容器中。缓冲液缓冲液A 20mM磷酸钠，60mM NaCl，pH5.2缓冲液B 20mM磷酸钠，100mM NaCl，pH6.0缓冲液C 100mM磷酸钠，500mM NaCl，pH8.0缓冲液D 100mM乙酸，1M HaCl，pH4.0缓冲液E 50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM NaCl，pH8.0缓冲液F 6M盐酸胍，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液G 1.8M硫酸铵，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液H 0.9M硫酸铵，100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液I 100mM磷酸钠，pH7.0缓冲液J 50mM Tris/Tris，HCl，pH9.0缓冲液K 50mM Tris/Tris，HCl，0.2M NaCl，pH9.0缓冲液L 50mM Tris/Tris，HCl，1.0M NaCl，pH9.0缓冲液M 10mM磷酸钠，0.9％w/v NaCl，pH7.0缓冲液N 16.3mM磷酸钾，2.5mM NaCl，2％(w/v)甘露糖醇，pH6.9溶液WFI2.5M氢氧化钠0.5M氢氧化钠0.2M氢氧化钠0.01M氢氧化钠2.5M盐酸1M乙酸0.2％(w/v)硫酸铜五水合物(CuSO4·5H2O)50mM乙二胺四乙酸的二钠或四钠盐(Na2EDTA或者Na4EDTA)。柱的参数
纯化表步骤容积 [sCR-1] 蛋白sCR-1总 …蛋白 累积回(L)(G/L) (G/L) 量(G) (G)收率(％)介质905 0.05 未检测出 46.2 未检测出 100SSFF洗脱物 45.70.952.4943.311.894IMAC洗脱物 43.41.001.8244.181.996Buryl洗脱物 21.62.102.2445.250.198DEAE洗脱物 10.04.083.9440.839.489HW-55F 21.71.681.6536.435.879洗脱物纯化的sCR-1 6.8 5.335.1836.335.379用HPLC测定的sCR-1用280nm的吸光度测定的蛋白质(ε＝1.10mLmg-1cm-1)
权利要求
1.一种从一个含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白的方法，将所述的混合物依次与一种阳离子层析支持剂、金属亲合层析支持剂、一种分子排阻层析支持剂相接触并从每个支持剂中选择性地洗脱出蛋白。
2.按照权利要求1所述的方法，其中受体从CR1、CR2、CR3和CR4中选择。
3.按照权利要求2所述的方法，其中受体是CR1及其片段。
4.按照权利要求3所述的方法，其中受体是一个CR1的可溶性片段。
5.按照权利要求4所述的方法，其中受体是TP10HD。
6.按照权利要求1所述的方法，其中阳离子层析支持剂选自于CM-23-、CM-32-、CM-52-纤维素；CM-和SP-交联葡聚糖，CM-和S-琼脂糖以及CM-650 S TOYOPEARL中，并且用加入一个缓冲过的盐溶液进行洗脱。
7.按照权利要求6所述的方法，其中支持剂是S-琼脂糖，盐是氯化钠。
8.按照权利要求6所述的方法，其中盐溶液是100mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH8.0。
9.按照权利要求1所述的方法，其中金属亲合支持剂选自于硅胶，琼脂糖以及聚乙烯异丁烯酸共聚物中。
10.按照权利要求9所述的方法，其中取代基从IDA和TED中选择。
11.按照权利要求10所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLAF-CHELATE 650M。
12.按照权利要求1所述的方法，其中金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一个咪唑盐缓冲液选择性洗脱补体受体。
13.按照权利要求12所述的方法，其中咪唑盐洗脱缓冲液由50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM氯化钠组成，pH为8.0。
14.按照权利要求1所述的方法，其中分子排阻层析剂从SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55-F中选择。
15.按照权利要求14所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLHW55-F并且洗脱液为10mM磷酸钠，0.9％(w/v)的氯化钠，pH为7。
16.一种从含有一种补体受体蛋白组分的细胞条件培养基中纯化这种补体受体蛋白的方法，对介质依次进行(a)阳离子交换层析，(b)固定的金属亲合层析，(c)疏水性相互作用层析，(d)阳离子交换层析，和(e)分子排阻层析。
17.按照权利要求16所述的方法，其中阳离子交换层析所使用的支持剂是CM-23-、CM-32-、CM-52-纤维素；CM-和SP-交联葡聚糖，CM-和S-琼脂糖以及CM-650 STOYOPEARL中的一种，并且通过一个缓冲过的盐溶液洗脱。
18.按照权利要求17所述的方法，其中支持剂是S-琼脂糖，盐是氯化钠。
19.按照权利要求18所述的方法，其中盐溶液是100mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH8.0。
20.按照权利要求17所述的方法，其中金属亲合支持剂是选自于硅胶，琼脂糖以及聚乙烯异丁烯酸共聚物中。
21.按照权利要求20所述的方法，其中取代基从IDA和TED中选择。
22.按照权利要求21所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLAF-CHELATE 650M。
23.按照权利要求16所述的方法，其中金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M并且用一个咪唑盐缓冲液选择性洗脱补体受体。
24.按照权利要求23所述的方法，其中咪唑盐洗脱缓冲液由50mM咪唑，100mM磷酸钠，500mM氯化钠组成，pH为8.0。
25.按照权利要求16所述的方法，其中疏水性相互作用层析支持剂选自于烷基C2-C8-琼脂糖、芳基琼脂糖、烷基硅胶、烷基-有机聚合物树脂中。
26.按照权利要求25所述的方法，其中支持剂选自于丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖以及丁基-、苯基-和醚-TOYOPEARL中。
27.按照权利要求26所述的方法，其中支持剂为丁基-TOYOPEARL。
28.按照权利要求20所述的方法，其中支持剂为丁基-TOYOPEARL并且用一个低浓度盐缓冲液选择性地洗脱蛋白。
29.按照权利要求28所述的方法，其中选择性地洗脱蛋白的缓冲液含100mM磷酸钠，pH7.0。
30.按照权利要求16所述的方法，其中阴离子交换层析所使用的支持剂是DEAE-纤维素，DEAE-，QAE-交联葡聚糖，DEAE-，Q-琼脂糖以及TOYOPEARL DEAE 650S中的一种。
31.按照权利要求30所述的方法，其中所说的支持剂为TOYOPEARL DEAE 650S。
32.按照权利要求16所述的方法，其中分子排阻层析所使用的支持剂是SEPHACRYL，UTROGEL，FRACTOGEL，SUPEROSE以及TOYOPEARL HW55F中的一种。
33.按照权利要求32所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARLHW55F。
34.一种从一种细胞条件培养基中纯化一种补体受体蛋白的方法，包括(a)浓缩细胞条件培养基；(b)在一种阳离子层析支持剂上吸附补体受体蛋白；(c)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白；(d)在一种固定的金属亲合层析支持剂上洗脱冲洗后的蛋白；(e)吸附从步骤中洗脱后的蛋白；(f)用至少一种缓冲液冲洗吸附后的蛋白；(g)洗脱冲洗后的蛋白；(h)在一种疏水性相互作用层析支持剂上吸附从步骤(g)中洗脱过的蛋白；(i)选择性地洗脱这种蛋白；(j)在一种阴离子交换支持剂上吸附从步骤(h)中洗脱过的蛋白；(k)洗脱吸附后的蛋白；(l)对来源于步骤(k)中的洗脱物进行分子排阻层析；(m)由此回收这种蛋白。
35.按照权利要求34所述的方法，包括能够如果存在的任何病毒灭活的步骤。
36.按照权利要求35所述的方法，其中所说的病毒灭活步骤在步骤(i)之后步骤(j)之前和/或在步骤(g)之后步骤(h)之前进行。
37.按照权利要求36所述的方法，其中所说的病毒灭活步骤包括用碱或盐酸胍对洗脱液进行处理。
38.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(b)的阳离子交换支持剂为磺酸盐取代的琼脂糖。
39.按照权利要求34所述的方法，其中固定的金属亲合支持剂为TOYOPEARL AF-CHELATE 650M。
40.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(j)的阴离子交换支持剂选自于二乙氨乙基，季氨基乙基和季铵取代的树脂，交联葡聚糖，琼脂糖或TOYOPEARL中。
41.按照权利要求40所述的方法，其中阴离子交换支持剂为二乙氨乙基取代的TOYOPEARL。
42.按照权利要求34所述的方法，其中步骤(h)的疏水性相互作用层析剂选自于烷基C2-C8-琼脂糖、芳基-琼脂糖、烷基硅胶、烷基-有机聚合物树脂中。
43.按照权利要求42所述的方法，其中支持剂选自于丁基-、苯基-和辛基-琼脂糖以及苯基-，醚-和丁基-TOYOPEARL中。
44.按照权利要求43所述的方法，其中支持剂为TOYOPEARL650。
45.按照权利要求44所述的方法，其中分子排阻层析使用的是TOYOPEARL HW55F。
46.按照权利要求34所述的方法，其中所说的经过层析步骤(1)的蛋白用沉淀、浓缩和超过滤回收。
47.一种从一个含有一种补体受体蛋白的混合物中纯化这种补体受体蛋白的方法，将所说的混合物吸附于一个固定金属亲合支持剂上，冲洗吸附后的蛋白，洗脱并且回收此蛋白。
48.按照权利要求47所述的方法，其特征在于在固定亲合层析支持剂吸附之前或之后，加入一步或多步蛋白纯化步骤。
全文摘要
本发明涉及固定的金属亲合层析法在补体受体蛋白纯化中的应用。
文档编号C07K14/715GK1130353SQ94193182
公开日1996年9月4日 申请日期1994年7月6日 优先权日1993年7月9日
发明者T·M·史密夫, G·福伦纳-瓦泽曼 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司
再多了解一些
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