专利名称：新型硼酸或硼酸酯类化合物、制备方法及在药学上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及一类新型硼酸或硼酸酯类化合物，制备方法和在药学上的应用。
背景技术：
目前，恶性肿瘤仍然是威胁人们生命的主要疾病之一。在我国，恶性肿瘤的发病率甚至仍在上升。虽然由于流行病学的进步，早期诊断和治疗方法的进一步改进，癌症的治疗和预防在最近几年中已取得不少的成就。例如外科手术和放射治疗的不断成熟，新的治疗方法如基因治疗等的不断出现，但迄今为止还无法取代化疗。另一方面，由于现有的抗癌药物，虽然具有一定疗效，但它们大多是细胞毒药物，具有严重的毒副作用。于是，研究和开发新型高效低毒的抗癌新药是无法回避的当务之急。
在细胞中，蛋白质降解的过程需要并涉及到一种叫辅酶因子(ubiquitin)与细胞蛋白的共价键结合。这种结合体被26S蛋白水解复合体所水解。而这种26S蛋白水解复合体含有一种20S蛋白酶体(proteasome)。正是这种蛋白酶体催化了细胞蛋白的分裂增生。细胞周期因子(Cyclins)是一种控制细胞周期循环的蛋白质。它的降解反应就涉及到上述辅酶因子/蛋白酶体催化的过程。抑制了蛋白酶体的催化作用，也就抑制了细胞周期因子进行细胞分裂增生的周期循环的作用。肿瘤细胞由于丧失了细胞周期运作的调节功能而无限增殖。于是，抑制蛋白酶体，则可有效地阻止细胞增殖(但不是杀细胞)。进而促进细胞凋亡，达到治疗多种肿瘤的作用。可以认为，蛋白酶体抑制剂是一类新型的广谱抗癌药物。同时，由于它们是抑制细胞增殖，而不是杀细胞，这类药物应具有较低的毒副作用。因此，寻找蛋白酶体抑制剂已成为抗癌药物研发的一种重要的新策略新方向，并被认为是20世纪末抗癌药物研究最重大的进展之一。
美国专利US 5780454公开了一类硼酸和硼酸酯的有机化合物。该系列化合物是通过有机合成反应制得。该系列化合物能特异地抑制蛋白酶体(proteasome)的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗。其具有代表性的化合物结构为 LDP-341蛋白酶体抑制剂由美国Millennium公司研发，已成功进入第三期临床试验，美国Clinical Cancer Research(2002)，8(8)，2505-2511报道了新型蛋白酶体抑制剂PS-341治疗恶性肿瘤的I期临床试验。Oncologist(2002)，7(1)，9-16报道了蛋白酶体抑制剂PS-341的进展。Cancer Research(2002)，62(4)，1083-1086报道了一种治疗T细胞白血病作用很强的药物蛋白酶体抑制剂PS-341。Seminars inOncology(2001)，28(6)，613-619报道了蛋白酶体抑制剂的抗癌作用，PS-341的发展。WO 9613266报道了硼酸和硼酸酯类化合物的合成和应用。LDP-341目前在美国、加拿大和欧洲同时进行治疗多发性骨髓瘤600个病例的第三期临床试验。在治疗成人T细胞白血病的试验中显示了很强的作用。并被美国FDA定为快速审批药物。该化合物由于有良好的选择性和明显的低毒副作用显示了令人振奋的临床应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供新一类选择性良好且毒副作用低的新型硼酸和硼酸酯类化合物，并通过改变背景技术化合物LDP-341的多肽结构，增加药物在体内的稳定性和生物利用度。它们作为20S蛋白酶抑制剂，能阻断肿瘤细胞增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗和预防。
本发明新型硼酸和硼酸酯类化合物具有下述式I结构 其中R1和R2组成一环，二环或三环结构，每个环可以是饱和或不饱和的4到12元杂环，并可以取代1到3个基团，为酮基，羟基，酰基，酰氧基，磺酰基，烷基，烷氧基，卤基和芳基等。其中以下基团为优选结构 其中A1和A2可以是独立的氢，甲基，乙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，胺基和酰胺基等。
R5和R6为可以是独立的氢，芳基，甲基，乙基，丙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，酰胺基或胺基等。
R3是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基(取代芳基为A1和A2)，饱和或不饱和的5到10元杂环(取代芳基为A1和A2)。
R4是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基(取代芳基为A1和A2)，饱和或不饱和的5到10元杂环(取代芳基为A1和A2)。
X是C(O)NH-，-SO2-NH-，-CH2NH-，-CH(OH)CH2-，-CH(OH)CH(OH)-，-CH(OH)CH2NH-，-CH＝CH-，-C(O)CH2-，-SO2-CH2-，CH2C(O)NH-，或-NH-C(O)-。
Z1和Z2是独立的羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，或在一起形成含有两个羟基的直链或环合的化合物，可以是C，也可以是N，S或O组成的杂环化合物。
本发明具有代表性的优选化合物具有下述化合物1、2、3的结构 本发明通过对20S蛋白酶体活性的研究发现，化合物1有很强的抑制20S蛋白酶体的活性。
本发明所要解决的另一技术问题，是公开上述新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法。
本发明公开的新型硼酸和硼酸酯类化合物(式I)由下式反应获得
R1、R2、R3、R4、X、Z1、Z2的定义如上所述。
本发明实施例1，详细描述了化合物1的制备方法，该化合物的制备过程如下式 a1.ClCO2C2H5/(C2H5)3N；2.NaN3/C6H6bL-Phenylalanine(L-苯基丙氨酸)，H2O，dioxane，50℃cN-Methyl morpholine，isobutyl chloroformate，triethylamine，THFdphenylboric acid，H2O/ether化合物1的制备工艺包括将邻苯二酸单酯4先在三乙铵和四氢呋喃中被氯甲酸乙酯活化，和叠氮化钠的水溶液反应得到酰叠氮；酰叠氮在甲苯中回流2小时得异氰酸酯5；所得到的异氰酸酯和氨基酸于硷性条件下在水和二氧环己烷溶液中加热反应(50℃)4小时得到化合物6，化合物6再与已知化合物硼酸酯7用混合酸酐法反应得化合物8，8再水解得到硼酸化合物1。
采用基本相同的方法，本发明实施例2、3分别提供了化合物2、3的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述新型硼酸或硼酸酯类化合物在制备与20S蛋白酶体活性有关疾病的药物中的应用。
本发明新型硼酸或硼酸酯类化合物能特异性抑制蛋白酶体(20Sproteasome)的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，可用于治疗和预防人和动物的恶性肿瘤等多种疾病。特别是能有效地抑制骨髓癌，淋巴细胞白血病，前列腺癌，胰腺癌以及结肠癌等多种人体肿瘤细胞的生长。
本发明新型硼酸或硼酸酯类化合物亦可用于治疗艾滋病，牛皮癣，心血管系统疾病和多种炎症等。
此类硼酸和硼酸酯化合物在肿瘤或其它疾病治疗过程中，可以是单药治疗，亦可以是与2种，3种或更多药物联合治疗，同时给药，或不同先后次序给药。这里所说的联合治疗，可以是与其它西药，中草药合并使用，或与激素治疗，放射治疗，免疫治疗，化疗，冷冻治疗以及基因治疗。
本发明提供的药物产品治疗肿瘤及其它疾病，这些产品含有有效剂量的此类硼酸和硼酸酯化合物和其它制药工业所采用的一切适宜添加剂，以及各种适宜的给药途经。
药物生产工艺包括使用无毒的制药工业所接受的药物前体为原料，采用多种方法合成此类硼酸和硼酸酯化合物。药物生产工艺还包括使用制药工业所接受的溶剂作为此类硼酸和硼酸酯化合物的溶媒，例如水，矿物油，食用油，二甲基亚砜等。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成口服给药，局部用药，吸入给药，肛门给药等剂型。使用无毒的制药工业所接受的材料作为载体，附加剂，赋型剂。再次指出的是给药方式可以是联合用药。可服给药剂型包括片剂，胶囊，酊剂，锭剂，口服糖浆或其它一切适用剂型。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成系统给药剂型，包括皮下注射，皮内注射，肌肉注射，经脉注射，脊椎注射，鞘内注射，或其它任何注射给药和滴注。除此之外，此类硼酸和硼酸酯化合物制剂除含有有效剂量外，尚含有其它药学上一切可能的无毒物质。包括一种或多种载体，稀释剂，附加剂，以及如果需要的话，其它药用成份。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成任何形式的口服剂型，包括片剂，锭剂，软硬胶囊，可服水剂，酊剂，口服混悬液，粉剂，乳化剂等。口服剂型可含有一种或多种甜味剂，矫味剂，颜色剂及防腐剂，以保证色彩完美和便于服用。
此类硼酸和硼酸酯化合物片剂的赋型剂可以是惰性的稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳酸钙，磷酸钙，磷酸钠；制颗粒剂玉米淀粉，藻元酸；粘合剂淀粉，明胶或是阿拉伯胶；滑润剂硬脂酸，硬脂酸镁或滑石粉。采用一切已知技术，制成包衣或无衣片剂。包衣剂型包括肠溶衣和缓释剂型。用于缓释剂型的材料可以是甘油单脂或甘油二脂盐。
此类硼酸和硼酸酯化合物胶囊可以是硬胶囊，亦可以是软胶囊。用于硬胶囊的材料可以是碳酸钙，磷酸钙或高领土。用于软胶囊的材料如水，油类包括花生油，橄榄油或液态石蜡。
此类硼酸和硼酸酯化合物口服水型混悬液可将其有效剂量与合适的稀释剂配制而成。其稀释混悬剂可以是碳羟甲基纤维素钠或甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，西黄耆胶，阿拉伯胶。分散剂或湿润剂包括天然磷脂，如卵磷脂，或烯啶氧化物与脂肪酸的缩合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯与脂肪酸部分酯化缩合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪缩合产物，如聚乙烯山梨醇甲酯酸盐。此类硼酸和硼酸酯化合物口服水型混悬液也可能含有一种或多种防腐剂，如乙基对或邻羟基苯安息香盐；含一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
此类硼酸和硼酸酯化合物的油型混悬液可将其有效剂量混悬于植物油中，如花生油，橄榄油，芝麻油，可可油。或是矿油，如液态石蜡。该制剂亦可含有稀释剂，如蜂蜡，蜡，或十六烷醇，上文所述的甜味剂，以及矫味剂和稳定剂，如抗氧化剂维生素C。
采用如上所述的分散剂，湿润剂，混悬剂，防腐剂，矫味剂，甜味剂，以及颜色剂，此类硼酸和硼酸酯化合物亦可制成水包油型制剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成水包油型乳化剂。其油相可以是如上所述的植物油，如橄榄油，花生油，等。亦可以是液态石蜡，矿油，或是二类的混合物。乳化剂可以是天然的乳化剂，如金合欢胶，或是西黄耆胶，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇的脂或半脂化物，如山梨糖单脂。亦可是人造化工材料，氧化乙烯半脂缩合物，如聚乙烯山梨醇单脂盐。此类硼酸和硼酸酯化合物的型乳化制剂亦可含有甜味剂和矫味剂等。
此类硼酸和硼酸酯化合物的糖浆剂和酊剂可采用甜味剂，如丙醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。该制剂亦可含有湿润剂，防腐剂，矫味剂，颜色添加剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物的注射剂可采用无菌注射液或是油状混悬液。其可运用药剂学上一切适用的分散剂，湿润剂或混悬剂。该制剂可以是无菌透明液，使用药剂学上一切适用的稀释剂，如，水，Ringer’s溶液和生理盐水等。此外，无菌油脂类亦可作为溶剂或混悬剂。其可以是合成的甘油单脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。
此类硼酸和硼酸酯化合物亦可制成栓剂，如肛门栓剂等。栓剂可由一定量的Cycolinx与相应的无刺激赋型剂组合而成。赋型剂在常温下为固体，但在肛门体温下液化而释放药物。适用的赋型剂包括可可脂和聚乙烯二醇类。
此类硼酸和硼酸酯化合物的系统给药剂型，根据所用载体浓度，可以是混悬型，亦可是溶解型。为了使用便利或减轻病人痛苦，可添加防腐剂，缓冲剂和局部麻醉剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物亦可作为兽医用药。为便于动物服用，含有该类化合物的制剂可加入动物词料中或饮水中。亦可制成方便的剂型作为动物的食品或饮品。
对代表性化合物1的初部试验显示本发明一系列化合物有很强的抑制20S蛋白酶体的活性(ki＝0.55nM)。与LDP-341(ki＝0.62nM)相比，至少有同样强的活性。另外，该类化合物改变了LDP-341类化合物的多肽结构，具有在体内更稳定和更易被吸收的优点。从代表性化合物1这样强的体外活性来看，完全能像LDP-341一样选择性的阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，有效地抑制人体肿瘤细胞生长，选择性好，毒副作用低.而且通过结构改造，增加了药物在体内的稳定性和生物利用度。进一步的生物试验正在进行中。
具体实施例方式实施例1化合物1的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(2，4-dioxo-1，4-dihydro-2H-quinazolin-3-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid1.将苯二酸单酯(1g，5.55mmol)和三乙铵(1.55ml，11.1mmol)溶于四氢呋喃(15ml)中，并冷却到-10℃。滴加入氯甲酸乙酯(0.8ml，8.33mmol).所得混合物在冰水浴冷却下搅拌1小时。慢慢滴加叠氮化钠(0.9g，13.87mmol)的水溶液(5.4ml)并继续搅拌1小时。加50ml水于反应混合物，并用甲苯(3×10ml)提取化合物。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后将四氢呋喃蒸发掉。将甲苯溶液慢慢加热至回流。回流1.5小时后，冷却至室温将溶剂蒸发掉得异氰酸酯粗品5(0.9克)。1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.76(1H，s)，7.70(1H，m)，7.35(2H，m)，3.80(3H，s)；质谱MS m/z 177(M )。
2.上述中间体5(5mmol)和L-苯基丙氨基酸(7.5mmol)加于等体积(10ml)的水，二氧环己烷和氢氧化钠溶液(1M)中。其混合物在50℃反应4小时。将有机溶剂蒸发掉。加20毫升水于剩余混合物中。用10％盐酸调节PH至3。将析出的固体过滤干燥得化合物6(1.1g)。
1H核磁共振(DMSO-d6，400MHz)8.50(1H，br)，7.93(1H，m)，7.52(H，m)，7.10(7H，m)，5.62(1H，dd，J＝6.5，10Hz)，3.50(1H，d，J＝6.5Hz)，3.45(1H，d，J＝10Hz，s)；质谱MS m/z 311(M )。
3.将等当量(2.7mmol)的化合物6和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移)。再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过滤并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物8(1g)。质谱MS(EI)m/z 558(MH) 。
4.在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入化合物8(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物1(0.2g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.93(1H，s)，7.82(1H，s)，7.49(1H，s)，7.18(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.05(2H，s)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，165.9(C＝O)，155.7(C＝O)，140.2(C)，137.0(C)，132.1(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，127.5(CH)，125.7(CH)，125.4(C)，124.2(CH)，56.8(CH)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3).质谱MS(EI)m/z 424(MH) 。
实施例2化合物2的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(2，4-dioxo-1，4-dihydro-2H-pteridin-3-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid将等当量(2.5mmol)的化合物2(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3-苯基-丙酸{2-(2，4-Dioxo-1，4-dihydro-2H-pteridin-3-yl)-3-phenyl-propionic acid}和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移).再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过滤并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物中间体0.8g)。质谱MS m/z 313(MH) 。
在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入上述中间体(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物2(0.15g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)8.17(1H，s)，7.84(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.05(2H，s)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，165.9(C＝O)，155.7(C＝O)，155.0(C)，146.8(CH)，140.2(C)，132.9(CH)，130.3(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，125.7(CH)，56.0(CH)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3).质谱MS(EI)m/z 426(MH) 。
实施例3化合物3的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(1-oxo-3，4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid将等当量(2.0mmol)的化合物2(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)-3-苯基-丙酸{2-(1-Oxo-3，4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-3-phenyl-propionic acid}和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移)。再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过虑并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物中间体0.3g)。质谱MS m/z296(MH) 。
在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入上述中间体(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物3(0.1g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.90(1H，s)，7.46(1H，s)，7.30(1H，s)，7.26(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.53(2H，m)，3.09(2H，s)，2.85(2H，m)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，166.1(C＝O)，140.2(C)，138.7(C)，133.9(C)，129.4(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，127.7(CH)，126.9(CH)，125.7(CH)，125.5(CH)，45.3(CH2)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，30.6(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3)。质谱MS(EI)m/z 409(MH) 。
实施例4化合物对20S蛋白酶体的抑制作用测定化合物对20S蛋白酶体的抑制作用之实验方法如文献所述(Stein etal，Biochemistry，35，3899-3980，1996；Rock et al，Cell.78，761-771，1994)。简述如下蛋白酶体由兔腰肌组织匀浆通过离心机得到不同组份，由硫酸氨(40％-80％)得到沉淀，再经过连续柱层析(Mono Q和Superose 6)分离得到，兔腰肌购于美国Sigma化学试剂公司。
酶作用底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC和抑制剂1(1-10μl，在DMSO中)加进2毫升的缓冲溶液中(20mM HEPES，0.5mM EDTA，0.035％SDS，pH7.8).加进3毫升的荧光仪(Hitachi 2000)测试管中。在37℃达到平衡后(约5分钟)，加进酶(1-10μl)，切断AMC的反应进程由440nm(lex＝380nm)处荧光吸收记录，再由荧光仪所联计算机计算出速率和Ki。(ki＝0.55nM)。与LDP-341(ki＝0.62nM)相比，有同样强的活性。
权利要求
1.新型硼酸和硼酸酯类化合物具有下述式I结构 其中R1和R2组成一环，二环或三环结构，每个环可以是饱和或不饱和的4到12元杂环，并可以取代1到3个基团，选自酮基，羟基，酰基，酰氧基，磺酰基，烷基，烷氧基，卤基或芳基；R3是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基，饱和或不饱和的5到10元杂环；R4是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基，饱和或不饱和的5到10元杂环；X是C(O)NH-，-SO2-NH-，-CH2NH-，-CH(OH)CH2-，-CH(OH)CH(OH)-，-CH(OH)CH2NH-，-CH＝CH-，-C(O)CH2-，-SO2-CH2-，CH2C(O)NH-，或-NH-C(O)-。Z1和Z2是各自独立的羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，或在一起形成含有两个羟基的直链或环合的化合物，可以是C，也可以是N，S或O组成的杂环化合物。
2.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于其中所述的R1和R2构成杂环基团包括 其中A1和A2分别是独立的氢，甲基，乙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，胺基或酰胺基；R5和R6分别是独立的氢，芳基，甲基，乙基，丙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，酰胺基或胺基。
3.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物1结构
4.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔〔2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物2结构
5.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物3结构
6.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于式I化合物由下式反应获得 R1、R2、R3、R4、X、Z1、Z2的定义如上所述。
7.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求3所述化合物1由下式制备过程制得 其中a1.CICO2C2H5/(C2H5)3N；2.NaN3/C6H6bL-Phenylalanine(L-苯基丙氨酸)，H2O，dioxane，5O℃cN-Methyl morpholine，isobutyl chloroformate，triethylamine，THFdphenylboric acid，H2O/ether制备工艺包括将邻苯二酸单酯4先在三乙铵和四氢呋喃中被氯甲酸乙酯活化，和叠氮化钠的水溶液反应得到酰叠氮；酰叠氮在甲苯中回流2小时得异氰酸酯5；所得到的异氰酸酯和氨基酸于硷性条件下在水和二氧环己烷溶液中加热反应，50℃ 4小时得到化合物6，化合物6再与已知化合物硼酸酯7用混合酸酐法反应得化合物8，8再水解得到硼酸化合物1。
8.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求4所述化合物2由2(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3-苯基-丙酸和硼酸酯7反应获得。
9.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求5所述化合物3由2(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)-3-苯基-丙酸和硼酸酯7反应获得。
10.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物在制备与20S蛋白酶体活性有关疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物能特异性抑制蛋白酶体的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，可用于治疗和预防人和动物的恶性肿瘤等多种疾病。
12.根据权利要求11所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物能有效地抑制骨髓癌，淋巴细胞白血病，前列腺癌，胰腺癌以及结肠癌等多种人体肿瘤细胞的生长。
13.根据权利要求10所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物可用于治疗艾滋病，牛皮癣，心血管系统疾病和多种炎症等。
14.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物是单药治疗或联合治疗，其中联合治疗是指与其它化疗联用，或与中草药联用，或与手术、放疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗等联用，采用同时治疗或不同次序先后治疗。
15.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物采用任何给药途经，任何给药方式。
16.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物剂型为针剂，片剂，丸剂，胶囊，膏剂，霜剂，贴剂，粉剂，喷雾剂，植入剂，栓剂或滴剂等。
全文摘要
本发明涉及一类新型硼酸或硼酸酯类化合物，制备方法和在药学上的应用。该类化合物能选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，有效地抑制人体肿瘤细胞生长。该类化合物改变了LDP－341类化合物的多肽结构，具有在体内更稳定和更易被吸收的优点。
文档编号C07F5/04GK1521171SQ0311538
公开日2004年8月18日 申请日期2003年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者李仁发, 冯子侠 申请人:上海雅虎制药股份有限公司
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及一类新型硼酸或硼酸酯类化合物，制备方法和在药学上的应用。
背景技术：
目前，恶性肿瘤仍然是威胁人们生命的主要疾病之一。在我国，恶性肿瘤的发病率甚至仍在上升。虽然由于流行病学的进步，早期诊断和治疗方法的进一步改进，癌症的治疗和预防在最近几年中已取得不少的成就。例如外科手术和放射治疗的不断成熟，新的治疗方法如基因治疗等的不断出现，但迄今为止还无法取代化疗。另一方面，由于现有的抗癌药物，虽然具有一定疗效，但它们大多是细胞毒药物，具有严重的毒副作用。于是，研究和开发新型高效低毒的抗癌新药是无法回避的当务之急。
在细胞中，蛋白质降解的过程需要并涉及到一种叫辅酶因子(ubiquitin)与细胞蛋白的共价键结合。这种结合体被26S蛋白水解复合体所水解。而这种26S蛋白水解复合体含有一种20S蛋白酶体(proteasome)。正是这种蛋白酶体催化了细胞蛋白的分裂增生。细胞周期因子(Cyclins)是一种控制细胞周期循环的蛋白质。它的降解反应就涉及到上述辅酶因子/蛋白酶体催化的过程。抑制了蛋白酶体的催化作用，也就抑制了细胞周期因子进行细胞分裂增生的周期循环的作用。肿瘤细胞由于丧失了细胞周期运作的调节功能而无限增殖。于是，抑制蛋白酶体，则可有效地阻止细胞增殖(但不是杀细胞)。进而促进细胞凋亡，达到治疗多种肿瘤的作用。可以认为，蛋白酶体抑制剂是一类新型的广谱抗癌药物。同时，由于它们是抑制细胞增殖，而不是杀细胞，这类药物应具有较低的毒副作用。因此，寻找蛋白酶体抑制剂已成为抗癌药物研发的一种重要的新策略新方向，并被认为是20世纪末抗癌药物研究最重大的进展之一。
美国专利US 5780454公开了一类硼酸和硼酸酯的有机化合物。该系列化合物是通过有机合成反应制得。该系列化合物能特异地抑制蛋白酶体(proteasome)的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗。其具有代表性的化合物结构为 LDP-341蛋白酶体抑制剂由美国Millennium公司研发，已成功进入第三期临床试验，美国Clinical Cancer Research(2002)，8(8)，2505-2511报道了新型蛋白酶体抑制剂PS-341治疗恶性肿瘤的I期临床试验。Oncologist(2002)，7(1)，9-16报道了蛋白酶体抑制剂PS-341的进展。Cancer Research(2002)，62(4)，1083-1086报道了一种治疗T细胞白血病作用很强的药物蛋白酶体抑制剂PS-341。Seminars inOncology(2001)，28(6)，613-619报道了蛋白酶体抑制剂的抗癌作用，PS-341的发展。WO 9613266报道了硼酸和硼酸酯类化合物的合成和应用。LDP-341目前在美国、加拿大和欧洲同时进行治疗多发性骨髓瘤600个病例的第三期临床试验。在治疗成人T细胞白血病的试验中显示了很强的作用。并被美国FDA定为快速审批药物。该化合物由于有良好的选择性和明显的低毒副作用显示了令人振奋的临床应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供新一类选择性良好且毒副作用低的新型硼酸和硼酸酯类化合物，并通过改变背景技术化合物LDP-341的多肽结构，增加药物在体内的稳定性和生物利用度。它们作为20S蛋白酶抑制剂，能阻断肿瘤细胞增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，从而可用于人和动物的多种疾病如恶性肿瘤的治疗和预防。
本发明新型硼酸和硼酸酯类化合物具有下述式I结构 其中R1和R2组成一环，二环或三环结构，每个环可以是饱和或不饱和的4到12元杂环，并可以取代1到3个基团，为酮基，羟基，酰基，酰氧基，磺酰基，烷基，烷氧基，卤基和芳基等。其中以下基团为优选结构 其中A1和A2可以是独立的氢，甲基，乙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，胺基和酰胺基等。
R5和R6为可以是独立的氢，芳基，甲基，乙基，丙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，酰胺基或胺基等。
R3是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基(取代芳基为A1和A2)，饱和或不饱和的5到10元杂环(取代芳基为A1和A2)。
R4是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基(取代芳基为A1和A2)，饱和或不饱和的5到10元杂环(取代芳基为A1和A2)。
X是C(O)NH-，-SO2-NH-，-CH2NH-，-CH(OH)CH2-，-CH(OH)CH(OH)-，-CH(OH)CH2NH-，-CH＝CH-，-C(O)CH2-，-SO2-CH2-，CH2C(O)NH-，或-NH-C(O)-。
Z1和Z2是独立的羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，或在一起形成含有两个羟基的直链或环合的化合物，可以是C，也可以是N，S或O组成的杂环化合物。
本发明具有代表性的优选化合物具有下述化合物1、2、3的结构 本发明通过对20S蛋白酶体活性的研究发现，化合物1有很强的抑制20S蛋白酶体的活性。
本发明所要解决的另一技术问题，是公开上述新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法。
本发明公开的新型硼酸和硼酸酯类化合物(式I)由下式反应获得
R1、R2、R3、R4、X、Z1、Z2的定义如上所述。
本发明实施例1，详细描述了化合物1的制备方法，该化合物的制备过程如下式 a1.ClCO2C2H5/(C2H5)3N；2.NaN3/C6H6bL-Phenylalanine(L-苯基丙氨酸)，H2O，dioxane，50℃cN-Methyl morpholine，isobutyl chloroformate，triethylamine，THFdphenylboric acid，H2O/ether化合物1的制备工艺包括将邻苯二酸单酯4先在三乙铵和四氢呋喃中被氯甲酸乙酯活化，和叠氮化钠的水溶液反应得到酰叠氮；酰叠氮在甲苯中回流2小时得异氰酸酯5；所得到的异氰酸酯和氨基酸于硷性条件下在水和二氧环己烷溶液中加热反应(50℃)4小时得到化合物6，化合物6再与已知化合物硼酸酯7用混合酸酐法反应得化合物8，8再水解得到硼酸化合物1。
采用基本相同的方法，本发明实施例2、3分别提供了化合物2、3的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述新型硼酸或硼酸酯类化合物在制备与20S蛋白酶体活性有关疾病的药物中的应用。
本发明新型硼酸或硼酸酯类化合物能特异性抑制蛋白酶体(20Sproteasome)的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，可用于治疗和预防人和动物的恶性肿瘤等多种疾病。特别是能有效地抑制骨髓癌，淋巴细胞白血病，前列腺癌，胰腺癌以及结肠癌等多种人体肿瘤细胞的生长。
本发明新型硼酸或硼酸酯类化合物亦可用于治疗艾滋病，牛皮癣，心血管系统疾病和多种炎症等。
此类硼酸和硼酸酯化合物在肿瘤或其它疾病治疗过程中，可以是单药治疗，亦可以是与2种，3种或更多药物联合治疗，同时给药，或不同先后次序给药。这里所说的联合治疗，可以是与其它西药，中草药合并使用，或与激素治疗，放射治疗，免疫治疗，化疗，冷冻治疗以及基因治疗。
本发明提供的药物产品治疗肿瘤及其它疾病，这些产品含有有效剂量的此类硼酸和硼酸酯化合物和其它制药工业所采用的一切适宜添加剂，以及各种适宜的给药途经。
药物生产工艺包括使用无毒的制药工业所接受的药物前体为原料，采用多种方法合成此类硼酸和硼酸酯化合物。药物生产工艺还包括使用制药工业所接受的溶剂作为此类硼酸和硼酸酯化合物的溶媒，例如水，矿物油，食用油，二甲基亚砜等。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成口服给药，局部用药，吸入给药，肛门给药等剂型。使用无毒的制药工业所接受的材料作为载体，附加剂，赋型剂。再次指出的是给药方式可以是联合用药。可服给药剂型包括片剂，胶囊，酊剂，锭剂，口服糖浆或其它一切适用剂型。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成系统给药剂型，包括皮下注射，皮内注射，肌肉注射，经脉注射，脊椎注射，鞘内注射，或其它任何注射给药和滴注。除此之外，此类硼酸和硼酸酯化合物制剂除含有有效剂量外，尚含有其它药学上一切可能的无毒物质。包括一种或多种载体，稀释剂，附加剂，以及如果需要的话，其它药用成份。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成任何形式的口服剂型，包括片剂，锭剂，软硬胶囊，可服水剂，酊剂，口服混悬液，粉剂，乳化剂等。口服剂型可含有一种或多种甜味剂，矫味剂，颜色剂及防腐剂，以保证色彩完美和便于服用。
此类硼酸和硼酸酯化合物片剂的赋型剂可以是惰性的稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳酸钙，磷酸钙，磷酸钠；制颗粒剂玉米淀粉，藻元酸；粘合剂淀粉，明胶或是阿拉伯胶；滑润剂硬脂酸，硬脂酸镁或滑石粉。采用一切已知技术，制成包衣或无衣片剂。包衣剂型包括肠溶衣和缓释剂型。用于缓释剂型的材料可以是甘油单脂或甘油二脂盐。
此类硼酸和硼酸酯化合物胶囊可以是硬胶囊，亦可以是软胶囊。用于硬胶囊的材料可以是碳酸钙，磷酸钙或高领土。用于软胶囊的材料如水，油类包括花生油，橄榄油或液态石蜡。
此类硼酸和硼酸酯化合物口服水型混悬液可将其有效剂量与合适的稀释剂配制而成。其稀释混悬剂可以是碳羟甲基纤维素钠或甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，西黄耆胶，阿拉伯胶。分散剂或湿润剂包括天然磷脂，如卵磷脂，或烯啶氧化物与脂肪酸的缩合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯与脂肪酸部分酯化缩合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪缩合产物，如聚乙烯山梨醇甲酯酸盐。此类硼酸和硼酸酯化合物口服水型混悬液也可能含有一种或多种防腐剂，如乙基对或邻羟基苯安息香盐；含一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
此类硼酸和硼酸酯化合物的油型混悬液可将其有效剂量混悬于植物油中，如花生油，橄榄油，芝麻油，可可油。或是矿油，如液态石蜡。该制剂亦可含有稀释剂，如蜂蜡，蜡，或十六烷醇，上文所述的甜味剂，以及矫味剂和稳定剂，如抗氧化剂维生素C。
采用如上所述的分散剂，湿润剂，混悬剂，防腐剂，矫味剂，甜味剂，以及颜色剂，此类硼酸和硼酸酯化合物亦可制成水包油型制剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物可制成水包油型乳化剂。其油相可以是如上所述的植物油，如橄榄油，花生油，等。亦可以是液态石蜡，矿油，或是二类的混合物。乳化剂可以是天然的乳化剂，如金合欢胶，或是西黄耆胶，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇的脂或半脂化物，如山梨糖单脂。亦可是人造化工材料，氧化乙烯半脂缩合物，如聚乙烯山梨醇单脂盐。此类硼酸和硼酸酯化合物的型乳化制剂亦可含有甜味剂和矫味剂等。
此类硼酸和硼酸酯化合物的糖浆剂和酊剂可采用甜味剂，如丙醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。该制剂亦可含有湿润剂，防腐剂，矫味剂，颜色添加剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物的注射剂可采用无菌注射液或是油状混悬液。其可运用药剂学上一切适用的分散剂，湿润剂或混悬剂。该制剂可以是无菌透明液，使用药剂学上一切适用的稀释剂，如，水，Ringer’s溶液和生理盐水等。此外，无菌油脂类亦可作为溶剂或混悬剂。其可以是合成的甘油单脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。
此类硼酸和硼酸酯化合物亦可制成栓剂，如肛门栓剂等。栓剂可由一定量的Cycolinx与相应的无刺激赋型剂组合而成。赋型剂在常温下为固体，但在肛门体温下液化而释放药物。适用的赋型剂包括可可脂和聚乙烯二醇类。
此类硼酸和硼酸酯化合物的系统给药剂型，根据所用载体浓度，可以是混悬型，亦可是溶解型。为了使用便利或减轻病人痛苦，可添加防腐剂，缓冲剂和局部麻醉剂。
此类硼酸和硼酸酯化合物亦可作为兽医用药。为便于动物服用，含有该类化合物的制剂可加入动物词料中或饮水中。亦可制成方便的剂型作为动物的食品或饮品。
对代表性化合物1的初部试验显示本发明一系列化合物有很强的抑制20S蛋白酶体的活性(ki＝0.55nM)。与LDP-341(ki＝0.62nM)相比，至少有同样强的活性。另外，该类化合物改变了LDP-341类化合物的多肽结构，具有在体内更稳定和更易被吸收的优点。从代表性化合物1这样强的体外活性来看，完全能像LDP-341一样选择性的阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，有效地抑制人体肿瘤细胞生长，选择性好，毒副作用低.而且通过结构改造，增加了药物在体内的稳定性和生物利用度。进一步的生物试验正在进行中。
具体实施例方式实施例1化合物1的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(2，4-dioxo-1，4-dihydro-2H-quinazolin-3-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid1.将苯二酸单酯(1g，5.55mmol)和三乙铵(1.55ml，11.1mmol)溶于四氢呋喃(15ml)中，并冷却到-10℃。滴加入氯甲酸乙酯(0.8ml，8.33mmol).所得混合物在冰水浴冷却下搅拌1小时。慢慢滴加叠氮化钠(0.9g，13.87mmol)的水溶液(5.4ml)并继续搅拌1小时。加50ml水于反应混合物，并用甲苯(3×10ml)提取化合物。合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后将四氢呋喃蒸发掉。将甲苯溶液慢慢加热至回流。回流1.5小时后，冷却至室温将溶剂蒸发掉得异氰酸酯粗品5(0.9克)。1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.76(1H，s)，7.70(1H，m)，7.35(2H，m)，3.80(3H，s)；质谱MS m/z 177(M )。
2.上述中间体5(5mmol)和L-苯基丙氨基酸(7.5mmol)加于等体积(10ml)的水，二氧环己烷和氢氧化钠溶液(1M)中。其混合物在50℃反应4小时。将有机溶剂蒸发掉。加20毫升水于剩余混合物中。用10％盐酸调节PH至3。将析出的固体过滤干燥得化合物6(1.1g)。
1H核磁共振(DMSO-d6，400MHz)8.50(1H，br)，7.93(1H，m)，7.52(H，m)，7.10(7H，m)，5.62(1H，dd，J＝6.5，10Hz)，3.50(1H，d，J＝6.5Hz)，3.45(1H，d，J＝10Hz，s)；质谱MS m/z 311(M )。
3.将等当量(2.7mmol)的化合物6和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移)。再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过滤并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物8(1g)。质谱MS(EI)m/z 558(MH) 。
4.在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入化合物8(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物1(0.2g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.93(1H，s)，7.82(1H，s)，7.49(1H，s)，7.18(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.05(2H，s)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，165.9(C＝O)，155.7(C＝O)，140.2(C)，137.0(C)，132.1(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，127.5(CH)，125.7(CH)，125.4(C)，124.2(CH)，56.8(CH)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3).质谱MS(EI)m/z 424(MH) 。
实施例2化合物2的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(2，4-dioxo-1，4-dihydro-2H-pteridin-3-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid将等当量(2.5mmol)的化合物2(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3-苯基-丙酸{2-(2，4-Dioxo-1，4-dihydro-2H-pteridin-3-yl)-3-phenyl-propionic acid}和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移).再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过滤并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物中间体0.8g)。质谱MS m/z 313(MH) 。
在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入上述中间体(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物2(0.15g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)8.17(1H，s)，7.84(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.05(2H，s)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，165.9(C＝O)，155.7(C＝O)，155.0(C)，146.8(CH)，140.2(C)，132.9(CH)，130.3(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，125.7(CH)，56.0(CH)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3).质谱MS(EI)m/z 426(MH) 。
实施例3化合物3的合成〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)〕丙胺]丁硼酸[(1R)-3-methyl-1[(2S)-1-oxo-3-phenyl-2[(1-oxo-3，4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)propyl]amino]butyl]boronic acid将等当量(2.0mmol)的化合物2(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)-3-苯基-丙酸{2-(1-Oxo-3，4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-3-phenyl-propionic acid}和氮甲基吗呤加入无水四氢呋喃(15ml)中并冷却到-20℃。加入等当量的氯甲酸异丁酯后搅拌5分钟。将上述混合物于-20℃加入到等当量的硼酸酯7的氯仿溶液(20ml)中(用冷却的四氢呋喃20ml帮助转移)。再加入等当量的三乙铵。在-20℃搅拌该混合物至室温。过虑并将溶剂蒸发掉。加乙酸乙酯100ml于剩余物中，用0.2N的盐酸，5％的碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗过再用无水硫酸钠干燥。过滤后蒸发至干。柱层析(LH20)分离得化合物中间体0.3g)。质谱MS m/z296(MH) 。
在相同体积(6ml)的水和乙醚中加入上述中间体(1mmol)，再加入5当量倍的苯基硼酸(5mmol)。室温下搅拌2小时。乙醚层用水提取3次。合并的水层用乙醚洗过2次后减压蒸发至干。用乙醚将剩余物磨洗，过滤，干燥得化合物3(0.1g)。
1H核磁共振(CDCl3，400MHz)7.90(1H，s)，7.46(1H，s)，7.30(1H，s)，7.26(1H，s)，7.21-7.08(5H，m)，4.92(1H，s)，3.6(1H，s)，3.53(2H，m)，3.09(2H，s)，2.85(2H，m)，1.83(1H，s)，1.5(2H，s)，1.01(6H，s)；13C核磁共振(CDCl3，400MHz)175.4(C＝O)，166.1(C＝O)，140.2(C)，138.7(C)，133.9(C)，129.4(CH)，128.4(CH)，127.9(CH)，127.7(CH)，126.9(CH)，125.7(CH)，125.5(CH)，45.3(CH2)，44.8(CH)，34.4(CH2)，32.0(CH2)，30.6(CH2)，26.4(CH)，22.4(CH3)。质谱MS(EI)m/z 409(MH) 。
实施例4化合物对20S蛋白酶体的抑制作用测定化合物对20S蛋白酶体的抑制作用之实验方法如文献所述(Stein etal，Biochemistry，35，3899-3980，1996；Rock et al，Cell.78，761-771，1994)。简述如下蛋白酶体由兔腰肌组织匀浆通过离心机得到不同组份，由硫酸氨(40％-80％)得到沉淀，再经过连续柱层析(Mono Q和Superose 6)分离得到，兔腰肌购于美国Sigma化学试剂公司。
酶作用底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC和抑制剂1(1-10μl，在DMSO中)加进2毫升的缓冲溶液中(20mM HEPES，0.5mM EDTA，0.035％SDS，pH7.8).加进3毫升的荧光仪(Hitachi 2000)测试管中。在37℃达到平衡后(约5分钟)，加进酶(1-10μl)，切断AMC的反应进程由440nm(lex＝380nm)处荧光吸收记录，再由荧光仪所联计算机计算出速率和Ki。(ki＝0.55nM)。与LDP-341(ki＝0.62nM)相比，有同样强的活性。
权利要求
1.新型硼酸和硼酸酯类化合物具有下述式I结构 其中R1和R2组成一环，二环或三环结构，每个环可以是饱和或不饱和的4到12元杂环，并可以取代1到3个基团，选自酮基，羟基，酰基，酰氧基，磺酰基，烷基，烷氧基，卤基或芳基；R3是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基，饱和或不饱和的5到10元杂环；R4是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基，饱和或不饱和的5到10元杂环；X是C(O)NH-，-SO2-NH-，-CH2NH-，-CH(OH)CH2-，-CH(OH)CH(OH)-，-CH(OH)CH2NH-，-CH＝CH-，-C(O)CH2-，-SO2-CH2-，CH2C(O)NH-，或-NH-C(O)-。Z1和Z2是各自独立的羟基，烷基，烷氧基，芳氧基，或在一起形成含有两个羟基的直链或环合的化合物，可以是C，也可以是N，S或O组成的杂环化合物。
2.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于其中所述的R1和R2构成杂环基团包括 其中A1和A2分别是独立的氢，甲基，乙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，胺基或酰胺基；R5和R6分别是独立的氢，芳基，甲基，乙基，丙基，甲氧基，乙氧基，氯，溴，氟，三氟甲基，酰胺基或胺基。
3.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喹唑啉-3)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物1结构
4.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔〔2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物2结构
5.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物，其特征在于所述化合物为〔(1R-3-甲基-1[(2S)-1-羰基-3-苯基-2〔(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)〕丙胺]丁硼酸，具有下述化合物3结构
6.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于式I化合物由下式反应获得 R1、R2、R3、R4、X、Z1、Z2的定义如上所述。
7.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求3所述化合物1由下式制备过程制得 其中a1.CICO2C2H5/(C2H5)3N；2.NaN3/C6H6bL-Phenylalanine(L-苯基丙氨酸)，H2O，dioxane，5O℃cN-Methyl morpholine，isobutyl chloroformate，triethylamine，THFdphenylboric acid，H2O/ether制备工艺包括将邻苯二酸单酯4先在三乙铵和四氢呋喃中被氯甲酸乙酯活化，和叠氮化钠的水溶液反应得到酰叠氮；酰叠氮在甲苯中回流2小时得异氰酸酯5；所得到的异氰酸酯和氨基酸于硷性条件下在水和二氧环己烷溶液中加热反应，50℃ 4小时得到化合物6，化合物6再与已知化合物硼酸酯7用混合酸酐法反应得化合物8，8再水解得到硼酸化合物1。
8.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求4所述化合物2由2(2，4-二羰基-1，4-二氢-2H-喋啶-3-苯基-丙酸和硼酸酯7反应获得。
9.根据权利要求6所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的制备方法，其特征在于权利要求5所述化合物3由2(1-羰基-3，4-二氢-1H-异喹啉-2)-3-苯基-丙酸和硼酸酯7反应获得。
10.根据权利要求1所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物在制备与20S蛋白酶体活性有关疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物能特异性抑制蛋白酶体的活性，选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发肿瘤细胞凋亡，可用于治疗和预防人和动物的恶性肿瘤等多种疾病。
12.根据权利要求11所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物能有效地抑制骨髓癌，淋巴细胞白血病，前列腺癌，胰腺癌以及结肠癌等多种人体肿瘤细胞的生长。
13.根据权利要求10所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于该药物可用于治疗艾滋病，牛皮癣，心血管系统疾病和多种炎症等。
14.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物是单药治疗或联合治疗，其中联合治疗是指与其它化疗联用，或与中草药联用，或与手术、放疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗等联用，采用同时治疗或不同次序先后治疗。
15.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物采用任何给药途经，任何给药方式。
16.根据权利要求10至13任一项所述的新型硼酸和硼酸酯类化合物的应用，其特征在于所述的药物剂型为针剂，片剂，丸剂，胶囊，膏剂，霜剂，贴剂，粉剂，喷雾剂，植入剂，栓剂或滴剂等。
全文摘要
本发明涉及一类新型硼酸或硼酸酯类化合物，制备方法和在药学上的应用。该类化合物能选择性地阻断肿瘤细胞的增殖，诱发细胞凋亡，有效地抑制人体肿瘤细胞生长。该类化合物改变了LDP－341类化合物的多肽结构，具有在体内更稳定和更易被吸收的优点。
文档编号C07F5/04GK1521171SQ0311538
公开日2004年8月18日 申请日期2003年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者李仁发, 冯子侠 申请人:上海雅虎制药股份有限公司
再多了解一些
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