点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描方法及装置与流程

1.本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现长寿命探针荧光成像无变形失真现象的智能点扫描方法，以及利用上述扫描方法实现的基于智能高速扫描控制系统的成像装置。


背景技术：

2.光学荧光成像是生物分析显微成像中最常用的技术之一，具有灵敏度高、特异性强、对活体生物组织友好的特点。光学荧光显微镜通过荧光探针特异性标记手段，可以准确获得单分子在细胞内的分布位置、探测离子浓度以及观察细胞运动过程，还可以实现蛋白分子相互作用的研究。作为光学荧光成像中的尖端技术，光学荧光超分辨成像技术还可以对细胞组织内的亚分辨率结构进行成像观察，极大地拓宽了人类对微观生命科学的研究视野。
3.区别于将整幅图像成像在系统像平面上的传统宽场荧光成像，荧光点扫描成像技术通过聚焦激光对样品进行逐点扫描，再逐点采集每个样品点的荧光，最后在计算机辅助下逐个像素重构整幅图像。单点扫描的方式可以避免场光源激发时样品上每一点的图像受到邻近点的衍射光或散射光的干扰，从而大大提高成像分辨率。
4.荧光成像技术依赖于荧光探针的激发和发射过程。大部分荧光探针的发光过程一般包含两个过程：由外界激发光引发的受激吸收过程，探针基态电子从基态跃迁至激发态；以及处于激发态的电子通过自发辐射过程从激发态跃迁回基态，能量以光的形式释放，即产生荧光发光。此过程所需的时间为荧光寿命。荧光寿命是荧光发光的重要特性之一，会直接影响成像的质量。目前，许多具有优良特性的新型长寿命、低毒性探针被开发、利用，如稀土上转换材料，在多种荧光成像技术中均展现出独特的优势，但它们的荧光寿命往往在微秒到毫秒的量级，过长的寿命在快速扫描成像时会带来严重的拖尾现象，极大地降低图像质量、限制扫描成像速度。拖尾现象是传统点扫描成像中的常见问题，当点扫描时，激光在像素的停留时间短于探针的寿命时间时，激光向下一个邻近点扫描，上一个样品点却仍未停止发射荧光，该荧光同样会被探测器接受并附加在当前样品点上。对于单独的一个长寿命纳米探针进行快速扫描成像，会形成一个彗星形的图像，即拖尾现象。因此对长寿命探针进行高速扫描成像的时候会导致图像发生变形、不清晰、不规则等现象，无法直观地获得所需的结构信息，更无法实现高速成像。
5.因此，需要在不降低成像分辨率和速度的前提下寻找解决在进行显微成像时激光扫描荧光显微成像技术的拖尾现象的方案。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描方法及装置。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明还提供一种点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描方法，包括如下步骤：
9.s1、激发光光源产生激发光提供给智能高速扫描模块；
10.s2、激发光首先经过声光调制器调制后穿过二向色镜再到达物镜，物镜将激发光聚焦在样品激发处实现间隔扫描；声光调制器在运动控制卡的控制下提供非逐点、可控间隔式扫描，运动控制卡产生该扫描方式所需要的脉冲波形和脉冲数量，再输入到声光调制器的驱动换能器使其驱动声光调制器实现非逐点、可控间隔式的扫描；
11.s3、样品激发处产生的荧光经过检测模块采集后传输至运动控制卡，运动控制卡获取检测模块的数据后再传输至数据采集系统，数据采集系统进行图像输出。
12.进一步地，上述方法的步骤s2中，记扫描像素面的像素点为n*n个(一般为偶数)，采用如下移位循环的光栅式点扫描的方式进行扫描：第一种：扫描完第1个像素点，直接跳转到第1 m个像素点，扫描完第1 m个像素点后，循环回到第2个像素点进行扫描，第2个像素点扫描结束后跳转到扫描第2 m个像素点，然后循环第3个像素点进行扫描，以此类推，当完成第n个像素点的扫描后结束行扫描，从第二行至第n行开始重复上述过程，直至整个二维像素面扫描结束；其中，m为整数且小于或等于n/2，m的数值可自定义设置和调节，但需要保证先后扫描的两个像素点的光斑区域不重叠。
13.第二种：扫描完第1个像素点，直接跳转到第1 m个像素点，扫描完第1 m个像素点后，循环回到第2行第1个像素点进行扫描，第2行第1个像素点扫描结束后跳转到扫描第2行第m个像素点，然后循环第3行第1个像素点进行扫描，以此类推，当完成第n行第1个像素点的扫描后结束列扫描，再返回至第1行第2个像素点，开始重复上述过程，直至整个二维像素面扫描结束；
14.进一步地，上述方法的步骤s3中，数据采集系统首先根据光电探测器采集的图像采集数值直接成像并显示出来；然后对于单个无样品重叠的像素区域，采用如下方式进行处理：
15.运动控制卡检测光电探测器采集的当前像素区域的探测值，若当前像素区域平均探测值低于前一像素区域平均探测值时，将当前像素区域探测值中的最大值设为噪声信号阈值；若当前像素区域平均探测值高于前一像素区域平均探测值时，将当前像素区域探测值中的最大值减去前一像素区域探测值中的最大值得到的差值设置为噪声信号阈值；运动控制卡将设定的噪声信号阈值发送给数据采集系统，数据采集系统将当前像素区域的探测值减去设定的噪声信号阈值后再次成像。
16.本发明还提供一种实现上述方法的点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描装置，包括激发光模块、智能高速扫描模块与检测模块；
17.所述激发光模块用于向智能高速扫描模块提供激发光；
18.所述智能高速扫描模块沿光线传播方向依次包括有声光调制器、高反低透二向色镜和物镜；所述智能高速扫描模块还包括有运动控制卡，所述声光调制器通讯连接于所述运动控制卡；激发光经第一可调反射镜反射后到达声光调制器后，经过高反低透二向色镜到达物镜，由物镜聚焦照射到样品激发处；声光调制器在运动控制卡的控制下提供间接扫描；
19.所述检测模块用于采集样品激发处发出的荧光数据并传输至运动控制卡，运动控
制卡获取检测模块的数据后传输至数据采集系统，数据采集系统进行成像。
20.进一步地，所述激发光模块沿光线传播方向依次包括有激发光光源、二分之一波片、线偏振片、高斯光扩束准直透镜组；激发光光源发射的激发光为高斯光束，激发光经过二分之一波片调节功率后到达线偏振片，通过线偏振片变为线偏振光后再经过高斯光扩束准直透镜组进行光束的准直扩束，然后达到智能高速扫描模块。
21.进一步地，所述声光调制器包括有x轴方向声光调制器和y轴方向声光调制器，x轴方向声光调制器和y轴方向声光调制器沿着光传播的方向依次设置。
22.进一步地，还包括有无限远矫正光学系统，无限远矫正光学系统包括扫描透镜和显微镜管镜；扫描透镜的工作面置于显微镜管镜的前焦面位置，激发光经过声光调制器后，依次经过扫描透镜和显微镜管镜后到达高反低透二向色镜。
23.进一步地，所述检测模块包括有半反半透镜、短通滤光片、荧光聚焦透镜、光电探测器；高反低透二向色镜、半反半透镜、短通滤光片、荧光聚焦透镜、光电探测器沿光线传播的方向依次设置，所述光电探测器通讯连接有所述运动控制卡；样品激发处发生的荧光经过高反低透二向色镜的透射后依次经过半反半透镜、短通滤光片、荧光聚焦透镜到达光电探测器，光电探测器进行光子数采集并将采集的数据传输至运动控制卡；运动控制卡获取光电探测器采集的数据后传输至数据采集系统，数据采集系统进行成像。
24.进一步地，激发光源为980nm的连续光半导体激光器。
25.更进一步地，所述光电探测器包括有光电倍增管和信号放大电路，所述光电倍增管将荧光信号转换为电信号后，信号放大电路对电信号进行放大并将信号转换为电压信号，信号放大电路将电压信号传输至运动控制卡后，运动控制卡将电压信号发送至数据采集系统，供数据采集系统的数据采集卡采集。
26.本发明的有益效果在于：利用本发明，可以解决传统长寿命荧光成像过程中因扫描速度过快导致图像产生的拖尾现象，同时不会降低扫描速度。
附图说明
27.图1为本发明实施例1中的装置结构示意图；
28.图2为本发明实施例2中间隔扫描的简单示意图；
29.图3为本发明实施例2中的同步信号时序图；
30.图4为本发明实施例2中利用现有方法扫描得到的拖尾荧光图与利用实施例2方法扫描得到的非拖尾荧光图对比图。
具体实施方式
31.以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
32.实施例1
33.本实施例提供一种点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描装置，如图1所示，包括激发光模块、智能高速扫描模块与检测模块。
34.所述激发光模块沿光线传播方向依次包括有激发光光源1、二分之一波片2、线偏
振片3、高斯光扩束准直透镜组4、第一可调反射镜5；激发光光源1发射的激发光为高斯光束，激发光经过二分之一波片2调节功率后到达线偏振片3，通过线偏振片3变为线偏振光后再经过高斯光扩束准直透镜组4进行光束的准直扩束，然后达到第一可调反射镜5。
35.所述智能高速扫描模块沿光线传播方向依次包括有声光调制器、高反低透二向色镜12和物镜13；所述智能高速扫描模块还包括有运动控制卡18，所述声光调制器通讯连接于所述运动控制卡18；激发光经第一可调反射镜5反射后到达声光调制器后，经过高反低透二向色镜12到达物镜13，由物镜聚焦照射到样品激发处；声光调制器在运动控制卡的控制下提供间接扫描。
36.需要说明的是，本实施例中，所述声光调制器包括有x轴方向声光调制器6和y轴方向声光调制器7，x轴方向声光调制器6和y轴方向声光调制器7沿着光传播的方向依次设置。x轴方向声光调制器6和y轴方向声光调制器7分别实现x轴方向和y轴方向的扫描，两者结合可以实现二维扫描。
37.由于需要利用光束扫描系统进行扫描，因此对光束的准直需要有较高要求，本实施例利用无限远矫正光学系统(relay光路)使光束的扫描始终不会偏离激发物镜。无限远矫正光学系统包括扫描透镜9和显微镜管镜10。扫描透镜9的工作面置于显微镜管镜10的前焦面位置，激发光经过声光调制器后，再经第二可调反射镜8反射依次经过扫描透镜9和显微镜管镜10，然后到达第三可调反射镜11，再由第三可调反射镜11反射至高反低透二向色镜12。
38.所述检测模块包括有半反半透镜14、短通滤光片15、荧光聚焦透镜16、光电探测器17；高反低透二向色镜12、半反半透镜14、短通滤光片15、荧光聚焦透镜16、光电探测器17沿光线传播的方向依次设置，所述光电探测器17通讯连接有所述运动控制卡18；样品激发处发生的荧光经过高反低透二向色镜12的透射后依次经过半反半透镜14、短通滤光片15、荧光聚焦透镜16到达光电探测器17，光电探测器进行光子数采集并将采集的数据传输至运动控制卡18；运动控制卡18获取光电探测器17采集的数据后传输至数据采集系统，数据采集系统进行成像。
39.在本实施例中，激发光源为980nm的连续光半导体激光器。
40.在本实施例中，所述光电探测器17包括有光电倍增管和信号放大电路，所述光电倍增管将荧光信号转换为电信号后，信号放大电路对电信号进行放大并将信号转换为电压信号，信号放大电路将电压信号传输至运动控制卡后，运动控制卡将电压信号发送至数据采集系统，供数据采集系统的数据采集卡采集。
41.实施例2
42.本实施例提供一种点扫描长寿命荧光显微成像的智能高速扫描方法，包括如下步骤：
43.s1、激发光光源产生激发光，激发光为高斯光束；激发光经过二分之一波片2调节功率后到达线偏振片3，通过线偏振片3变为线偏振光后再经过高斯光扩束准直透镜组4进行光束的准直扩束，然后达到第一可调反射镜5，经第一可调反射镜5反射进入x轴方向声光调制器；
44.s2、激发光首先经过声光调制器调制，然后经过第二可调反射镜8反射并依次扫描透镜9和显微镜管镜10，然后到达第三可调反射镜11；激发光经第三可调反射镜11反射后到
达高反低透二向色镜12，经过高反低透二向色镜12后到达物镜13，物镜13将激发光聚焦在样品激发处实现扫描；声光调制器在运动控制卡的控制下提供间隔扫描，运动控制卡产生间隔扫描的脉冲波形和脉冲数量，再输入到声光调制器的驱动换能器使其驱动声光调制器实现间隔扫描。
45.需要说明的是，因声光调制器具有随即寻址扫描，可避免传统扫描器件在间隔扫描时掠过中间间隔区域使得样品被激发产生无规则信号的问题。
46.进一步地，由于显微成像的扫描像素面是确定的，因此，在本实施例采用间隔扫描的方式，如图2(a,b)所示。假设扫描像素面的像素点为n*n个(一般为偶数)，采用如下移位循环的光栅式点扫描的方式进行扫描：
47.第一种：扫描完第1个像素点，直接跳转到第1 m个像素点，扫描完第1 m个像素点后，循环回到第2个像素点进行扫描，第2个像素点扫描结束后跳转到扫描第2 m个像素点，然后循环第3个像素点进行扫描，以此类推，当完成第n个像素点的扫描后结束行扫描，从第二行至第n行开始重复上述过程，直至整个二维像素面扫描结束；其中，m为整数且小于或等于n/2，m的数值可自定义设置和调节，但需要保证先后扫描的两个像素点的光斑区域不重叠。
48.第二种：扫描完第1个像素点，直接跳转到第1 m个像素点，扫描完第1 m个像素点后，循环回到第2行第1个像素点进行扫描，第2行第1个像素点扫描结束后跳转到扫描第2行第m个像素点，然后循环第3行第1个像素点进行扫描，以此类推，当完成第n行第1个像素点的扫描后结束列扫描，再返回至第1行第2个像素点，开始重复上述过程，直至整个二维像素面扫描结束；
49.以上间隔扫描方式仅为众多间隔扫描方式中的一种，提供了无任何一处拖尾的扫描成像，实现了在整个扫描像素面里，任何相邻时间间隔内扫描的像素点都不相邻。
50.图3展示了x轴与y轴方向的两个声光调制器工作时序图。首先，x轴aof按照上述间隔扫描方式进行扫描，1到n为x方向扫描一行像素区域的时序周期。当一行扫描结束后(即1到n时序周期完成)y方向aof开始启动使得激光光束运行至下一行像素区域起始位置。以上x与y轴aof的联动为扫描二维平面的一个周期，如此往复将二维平面扫描完成。
51.s3、样品激发处发生的荧光经过高反低透二向色镜12的透射后依次经过半反半透镜14、短通滤光片15、荧光聚焦透镜16到达光电探测器17，光电探测器进行光子数采集并将采集的数据传输至运动控制卡18；
52.运动控制卡18将光电探测器采集的图像采集数值传输至数据采集系统，数据采集系统将图像采集数值进行成像。
53.需要说明的是，运动控制卡作为扫描装置的上位机，其作用主要有如下两个方面：
54.1)输出模拟电平给声光调制器以实现随机寻址扫描。声光调制是一种外调制技术，与电光调制技术相比，它有更高的消光比(一般大于1000：1)、更低的驱动功率、更优良的温度稳定性和更好的光点质量以及低的价格；与机械调制方式相比，它有更小的体积、重量和更好的输出波形。传统的扫描器件都由电机驱动，受到机械控制，因此难以实现超快的扫描速度。此外，机械噪音带来的图像失真问题很难解决。声光调制器件由声光介质和压电换能器构成。当驱动源的某种特定载波频率驱动换能器时,换能器即产生同一频率的超声波并传入声光介质,在介质内形成折射率变化，光束通过介质时即发生相互作用产生衍射
而改变光的传播方向。即声光调制器加载特定的载波频率后，产生模拟光栅，进而对入射光的光强幅度进行调制以及使入射光产生衍射从而偏离入射方向达到随机寻址扫描的过程。随机寻址扫描能够完全避免以下由传统扫描器件带来的问题：扫描器件进行间隔扫描时(间隔距离大于光斑区域)，大距离的编码情况下，将导致扫描器件有几十到几百微秒的滞空时间，此期间内如果不对光源强度进行调制且将其调制为零，将会导致激光对滞空时间内扫描器件扫描经过的像素点进行激发，仍然会产生拖尾现象。因此本实施例以声光调制器作为扫描器件，改变输入电压就可改变激光出射方向。对其输入寻址电压信号使其进行间隔扫描避免拖尾现象的再次产生。
55.2)所述随机寻址方式能够避免样品处出现拖尾现象，而在非共焦扫描系统中，因没有针孔的阻挡，光电探测器在对整个成像区域进行探测时，除了焦平面上的像素点之外，若上一个像素点仍在发光，其发射的光子会让数据采集系统认为当前所扫描的位点也是存在信号，并将其呈现出来，因此进行下一个像素点扫描时，仍然会记录下前一个像素点发出的光子数，并成像在计算机上。如下一个像素点处无样品，即为黑色背景，则会出现少量信号；如下一个像素点处有样品，则会将少量信号增加在原样品处。上述采用声光调制器作为扫描器件进行随机寻址扫描的过程虽然能解决样品处的拖尾现象使图像成像清晰无变形，但仍然会导致无样品处出现类似噪声的信号以及有样品处出现信号微增现象。针对此现象，本实施例利用噪声信号阈值给定方式进行滤除，具体过程为：
56.数据采集系统首先根据光电探测器采集的图像采集数值直接成像并显示出来；然后对于单个无样品重叠的像素区域(即所有样品均为单个颗粒)，采用如下方式进行处理：
57.运动控制卡检测光电探测器17采集的当前像素区域的探测值，若当前像素区域平均探测值低于前一像素区域平均探测值时(判断此情况为目前像素区域无样品)，将当前像素区域探测值中的最大值设为噪声信号阈值；若当前像素区域平均探测值高于前一像素区域平均探测值时(判断此情况为目前像素区域有样品)，将当前像素区域探测值中的最大值减去前一像素区域探测值中的最大值得到的差值设置为噪声信号阈值；运动控制卡18将设定的噪声信号阈值发送给数据采集系统，数据采集系统将当前像素区域的探测值减去设定的噪声信号阈值后再次成像。
58.以上处理方法并不能彻底消除信号值的增加，但是可以有效降低增加幅度。
59.如图4所示，(a)图为现有扫描方法中像素停留时间是2us的快速成像图形，可以看出具有明显的拖尾、图像失真和变形等现象。(b)图为采用本实施例方法扫描得到的成像结果，相比(a)图，(b)图具有正确的图形形貌，能够直观的观察到成像样品的结构。
60.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。