烟草多酚氧化酶基因NtPPO-1的编辑方法、gRNA、引物对、基因编辑质粒及其试剂盒与应用与流程

本发明涉及基因编辑，具体涉及一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的编辑方法、grna、引物对、基因编辑质粒及其试剂盒与应用。

背景技术：

1、普通栽培烟草为异源四倍体植物，栽培烟草中ppo基因有多达15个家族基因。对烟草ntppo基因研究发现，不同的家族基因对烟草植株体内的ppo活性有不同的影响，且这种影响可能因品种不同而存在差异。同时，烟草的ppo活性不仅和烟叶加工品质相关，还与植株的病虫抗性相关，因此在通过ntppo基因敲除的编辑方法来改良烟叶ppo活性的时候，要平衡品质提升和病虫抗性的需求。烟草多酚氧化酶基因ntppo-1（loc107811292）在栽培烟草中，不是表达和活性最高的家族基因，该基因一定程度的失活，不会对植株ppo活性产生重大改变，同时又能显著提高烟叶的烘烤品质，达到植物生理需求和经济价值的平衡，是改良烟叶品质的优良候选基因。

2、因此，本领域技术人员致力于通过编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1，依次来改善烟叶品质。

技术实现思路

1、本发明提供的一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的编辑方法、grna、引物对、基因编辑质粒及其试剂盒与应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明公开了一种编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的grna，所述grna靶向所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的第一外显子，所述grna的核苷酸序列如seq id no.1或2所示，所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的核苷酸序列如seq id no：7所示，ntppo-1基因编号为loc107811292。

4、第二方面，本发明公开了一种编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的引物对，所述引物对包括具有如seq id no .3～6所示核苷酸序列的dna分子。

5、第三方面，本发明公开了一种编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑质粒，所述基因编辑质粒包含如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的grna和cas9的编辑基因。

6、第四方面，本发明公开了一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑试剂盒，包括：

7、如第二方面所述的引物对；和，

8、携带基础grna对应脱氧核苷酸序列的第一质粒；以及，

9、携带编码cas9编辑基因的第二质粒。

10、第五方面，本发明公开了一种编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的试剂盒，包括如第三方面所述的基因编辑质粒；以及维持所述基因编辑质粒转化活性的试剂；其中，

11、所述基因编辑质粒携带有编辑烟草多酚氧化酶ntppo-1的grna，所述grna靶向所述烟草ntppo-1基因的第一外显子，所述grna的核苷酸序列如seq id no .1或2所示，所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的核苷酸序列如seq id no：7所示，ntppo-1基因编号为loc107811292。

12、在本发明的较佳实施方式中，所述试剂盒还包括含有农杆菌gv3101的试剂。

13、第六方面，本发明公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带有如第三方面所述的基因编辑质粒。

14、第七方面，本发明公开了一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑质粒的构建方法，包括：

15、获得第一质粒并合成引物对，所述第一质粒携带如seq id no .1或2所示的基础grna对应的脱氧核苷酸序列，所述引物对依据所述基础grna对应的脱氧核苷酸序列设计获得，所述grna的靶序列位于所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的第一外显子；

16、利用引物对和第一质粒得到携带grna对应脱氧核苷酸序列的重组质粒；

17、对携带grna对应脱氧核苷酸序列的重组质粒进行酶切得到grna对应的dna分子，与酶切的携带cas9酶编码基因的第二质粒序列进行连接，得到所述基因编辑质粒。

18、第八方面，本发明公开了一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的编辑方法，包括：

19、获得烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的grna，所述grna的靶序列位于所述烟草ntppo-1基因的第一外显子，所述grna的核苷酸序列如seq id no .1或2所示，所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的核苷酸序列如seq id no：7所示，ntppo-1基因编号为loc107811292；

20、利用所述grna构建编辑烟草ntppo-1基因的基因编辑质粒；

21、将所述基因编辑质粒转入农杆菌中；

22、将转入了所述基因编辑质粒的农杆菌浸染烟草叶盘。

23、第九方面，本发明公开了一种如第一方面所述的grna、如第二方面所述的引物对、如第三方面3所述的基因编辑质粒或第四方面、第五方面任一项所述的试剂盒在烟草多酚氧化酶基因ntppo-1编辑中的应用，经过编辑后的烟草多酚氧化酶基因ntppo-1用于降低ppo活性，提高烟叶烘烤品质，提高植株的病虫抗性。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、本发明经过对烟草家族ppo基因进行系统的筛查和检测，根据ncbi的基因数据库，搜索到烟草的15个家族基因，下载了15个基因的基因组序列和mrna数据，设计了烟草15个家族基因的cdna表达检测引物，进行了rt-pcr和表达组测序，比较分析发现ntppo-1（loc107811292）基因的表达与其他家族基因有显著差异，不属于组成型表达，在不同的烟草品种来源植株中，表达量存在波动，且表达量排名属于中等水平，说明该基因的表达量变化不会导致植株生理性的重大改变，乃至影响植株的主要农艺性状和生长特性，因而推测，该基因的失活可能仅减弱多酚氧化酶的总体活性，不会影响其他产量性状，因此，以该烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的第一外显子作为编辑靶点区域进行双靶点敲除编辑，希望大幅降低该基因的表达，实验获得了大片段删除的纯合突变体植株，对该烟草的纯合突变植株通过rna表达测序和rt-pcr检测，结果表明纯合突变植株ntppo-1（loc107811292）表达量显著下降，烟叶的烘烤品质分析表面，ppo活性明显下降，烟叶褐化现象显著减轻，品质显著提升，而株高、抗病性、烟叶产量基本不收影响。

1.编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的grna，其特征在于，所述grna靶向所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的第一外显子，所述grna的核苷酸序列如seq id no .1或2所示，所述烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的核苷酸序列如seq id no：7所示，ntppo-1基因编号为loc107811292。

2.编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的引物对，其特征在于，所述引物对包括具有如seq id no .3～6所示核苷酸序列的dna分子。

3.编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑质粒，其特征在于，所述基因编辑质粒包含如权利要求1所述的烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的grna和cas9的编辑基因。

4.烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑试剂盒，其特征在于，包括：

5.编辑烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3所述的基因编辑质粒；以及维持所述基因编辑质粒转化活性的试剂；其中，

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有农杆菌gv3101的试剂。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带有如权利要求3所述的基因编辑质粒。

8.烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的基因编辑质粒的构建方法，其特征在于，包括：

9.一种烟草多酚氧化酶基因ntppo-1的编辑方法，其特征在于，包括：

10.如权利要求1所述的grna、如权利要求2所述的引物对、如权利要求3所述的基因编辑质粒或权利要求4～6任一项所述的试剂盒在烟草多酚氧化酶基因ntppo-1编辑中的应用，其特征在于，经过编辑后的烟草多酚氧化酶基因ntppo-1用于降低ppo活性，提高烟叶烘烤品质，提高植株的病虫抗性。