分裂式基因编辑系统及其用途的制作方法

本公开涉及分裂式基因编辑系统及其用途，包括多肽、载体、细胞、组合物、试剂盒及其方法。序列表本技术包含名称为“seq list.xml”的序列表xml文件，该文件大小为361 kb，创建于2023年11月17日。序列表中包含的信息通过引用并入本文。

背景技术：

1、crispr-cas9是一种新型基因组编辑工具，其可在引导rna（grna）的引导下在基因组靶位点进行切割，造成dna双链断裂（double-strand breaks, dsb）。dsb诱导细胞启动非同源末端连接（non-homologous end joining, nhej）或同源定向修复（homology-directed repair, hdr）机制。结合包含同源臂的供体模板，可利用hdr实现dna序列的精准插入或缺失，但其效率较低。基于cas9切口酶和脱氨酶开发的碱基编辑器（base editor，be）可实现四种类型的碱基转换，包括c→t、g→a、a→g和t→c。然而，其编辑窗口和编辑能力有限，并且脱靶率较高。而且，对于占已知致病突变约70%的其他突变类型，目前仍缺乏有效的基因组编辑工具。

2、david liu及其团队开发了一种新型基因编辑工具，即先导编辑器（primeeditor，pe）。pe无需造成dsb且无需供体模板dna，即可实现精准插入、删除以及全部12种类型的碱基转换。在最初版本的pe（pe1）中，使用可进行单链切割的cas9n-h840a，并将其c端与莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（m-mlv）融合，同时联合先导编辑引导rna（pegrna），所述pegrna的3’端具有延伸序列，其中所述延伸序列包含针对编辑位点的逆转录酶模板（rt模板）和引物结合位点（pbs）。pe1可实现单碱基取代以及短序列的插入和缺失，但其编辑效率相对较低。通常，仅有<5%的目标等位基因被转换为期望序列。为了提高pe1的编辑效率，在m-mlv中引入五个突变，以提高其热稳定性、反应持续性以及与dna和rna底物的亲和力，并抑制m-mlv的rnaseh活性。这就是第二代先导编辑系统（pe2）。与pe1相比，pe2在人细胞中的编辑效率提高了1.6至5.1倍。pe1和pe2均依赖细胞内源性修复过程，以模板中的编辑链替换未编辑链。通过向pe2中引入靶向编辑链的单引导rna（single guide rna，sgrna），在未编辑链上产生切口，可以促进上述替换过程，从而提高编辑效率，该系统称为pe3。通过优化sgrna的结合位置，可以在保持相对较低的插入和缺失（insertions and deletions，indels）率的同时获得更高的编辑效率，该系统称为pe3b。此外，据报道，pegrna的3′端降解会影响编辑效率。为此，研究人员在pegrna的3′端加入不同的rna保护结构，开发了经工程化改造的pegrna，例如epegrna和xr-pegrna。后续研究发现，细胞的dna错配修复机制（mismatch repair，mmr）会抑制pe基因编辑并导致额外的indel。基于这些发现，开发了表达显性负性错配修复蛋白mlh1（dominant-negative mlh1, mlh1dn）的pe系统，即pe4（pe2+mlh1dn）和pe5（pe3+mlh1dn）。通过利用mlh1dn抑制mmr，可以提高基因编辑效率。在上述pe系统不同版本的基础上，通过采用经过密码子优化的pe2蛋白、在spcas9中引入多个突变、以及调整cas9n-h840a与逆转录酶之间肽接头的长度和位置，可以获得进一步优化的pemax系统。此外，将不同版本的pe系统与丝氨酸重组酶组合，可以获得twin pe和paste系统，从而实现基因组中大段序列的精准插入和删除，以及染色体倒位和易位。

3、鉴于编辑类型多样、特异性高且脱靶率低，pe在基因编辑治疗中具有巨大潜力。而高效并精准地将pe递送至体内作用部位是其发挥功能的关键。病毒载体是基因治疗中广泛使用的递送工具。可通过病毒将目标基因导入接受体细胞以用于疾病治疗。该方式已应用于细胞、动物模型以及临床。常用的病毒载体包括但不限于腺病毒、慢病毒和腺相关病毒（aav）。aav具有相对较低的免疫原性，并且可以注射至靶部位。因此，aav是一种安全且有效的递送工具，并已广泛用于临床基因治疗。

4、然而，pe的大小约为6.5 kb，远超aav的装载容量（4.8 kb）。pe递送所面临的这一障碍限制了其进一步的临床应用。因此，本领域仍需要具有高效率的pe递送方法。

技术实现思路

1、本公开提供了以分裂形式将基因编辑系统（例如先导编辑器（pe）和碱基编辑器（be））递送至细胞中的组合物和方法。在一些实施方案中，将基因编辑系统分裂成两部分，并分别包装于两个载体中，例如两个aav载体中。用两个载体转染细胞后，所述两部分可通过rna反式剪接或内含肽介导的反式剪接重组形成一个完整的mrna或蛋白质，随后发挥基因编辑功能。在一些实施方案中，将基因编辑系统分裂成多于两个部分，并分别包装于多于两个的载体中。

2、本公开提供了cas9蛋白或其变体中的多个分裂位点。在一些实施方案中，本公开所鉴定的分裂位点位于cas9蛋白或其变体的seq id no: 1-10和12中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间。在一些实施方案中，分裂位点位于seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间，其中分裂的cas9蛋白或其变体的c端部分的n端前两个氨基酸被半胱氨酸和苯丙氨酸，或半胱氨酸和色氨酸替换。在一些实施方案中，所述分裂位点为212-213、269-270、309-310、367-368、459-460、554-555、940-941、959-960、1023-1026、1039-1040、1087-1088和1115-1116。

3、本文公开的分裂位点还可以组合使用。例如，在一些实施方案中，cas9蛋白或其变体在本文公开的两个分裂位点处分裂成三部分。本公开还公开了分裂位点与内含肽的多种新组合。

4、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间。

5、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间。

6、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

7、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含在第一分裂位点和第二分裂位点之间的全长cas9蛋白或其变体的部分，其中第一分裂位点位于第二分裂位点的上游，其中所述两个分裂位点的至少一个选自seq id no: 1-10和12中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间的位点，以及seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间的位点；其中，如果第一分裂位点位于seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间，则所述截短的cas9蛋白或其变体的n端前两个氨基酸被半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸替换。在一些实施方案中，所述两个分裂位点均选自seq id no: 1-10和12中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间的位点，以及seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间的位点；其中，如果第一分裂位点位于seq id no: 11的第一个与第二个氨基酸之间，则所述截短的cas9蛋白或其变体的n端前两个氨基酸被半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸替换。

8、在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。

9、在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸中的内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸中的内含肽为rma。

10、在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸进一步包含引导rna或编码其的序列。

11、在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。

12、在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶。在一些实施方案中，所述逆转录酶为m-mlv逆转录酶或其功能性变体。在一些实施方案中，基因编辑酶是脱氨酶。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

13、在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码2a肽（p2a）的序列。

14、在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码核定位信号（nls）的序列。

15、在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9切口酶（ncas9）。在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9n-h840a（seq id no: 23）、esp-cas9（seq id no:17）、hifi-cas9（seq id no: 18）、lz3-cas9（seq id no: 19）、spcas9-ng（seq id no:20）、sniper-cas9（seq id no: 21）、superficas9（seq id no: 22）或dcas9（seq id no:24）。

16、在一个方面，本公开提供了一种载体，其包含本文所述的多核苷酸。

17、在一些实施方案中，本文所述的载体为病毒载体。在一些实施方案中，本文所述的载体为质粒。病毒载体可包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。适用的载体、启动子和增强子元件是本领域已知的；用于产生重组构建体对象的许多载体、启动子和增强子元件可商购获得。

18、在一些实施方案中，本文所述的载体选自腺病毒、慢病毒和腺相关病毒（aav）。在一些实施方案中，本文所述的载体为aav。

19、在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文所述的多核苷酸。

20、在一些实施方案中，本文所述的组合物包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

21、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

22、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

23、在本文所述的组合物的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个引导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述引导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

24、在本文所述的组合物的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个引导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述引导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

25、在一些实施方案中，本文所述的组合物包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

26、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

27、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

28、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

29、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

30、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

31、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

32、在本文所述的组合物的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含引导rna或编码其的序列。

33、在本文所述的组合物的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

34、在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文所述的载体。

35、在一些实施方案中，本文所述的组合物包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸包含编码截短cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分割位点处分为两部分，其中所述分割位点位于所述全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 1-10中任一序列的第二个氨基酸与第三个氨基酸之间，或者位于所述全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第一个氨基酸与第二个氨基酸之间；和

36、其中第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

37、在本文所述的组合物的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个引导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述引导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

38、在本文所述的组合物的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个引导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述引导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

39、在一些实施方案中，本文所述的组合物包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，

40、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

41、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

42、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

43、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

44、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

45、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

46、在本文所述的组合物的一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含引导rna或编码其的序列。

47、在本文所述的组合物的一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

48、在本文所述的组合物的一些实施方案中，载体的至少一个为aav载体。在本文所述的组合物的一些实施方案中，两个载体均为aav载体。

49、在本文所述的组合物的一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9切口酶（ncas9）。在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9n-h840a（seq id no: 23）、esp-cas9（seq id no: 17）、hifi-cas9（seq id no: 18）、lz3-cas9（seq id no: 19）、spcas9-ng（seq id no: 20）、sniper-cas9（seq id no: 21）、superficas9（seq id no:22）或dcas9（seq id no: 24）。

50、在一个方面，本公开提供了一种细胞，其包含本文所述的多核苷酸。

51、在一些实施方案中，本文所述的细胞包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

52、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

53、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

54、在本文所述的细胞的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna的至少一种包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

55、在本文所述的细胞的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna的至少一种包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

56、在一些实施方案中，本文所述的细胞包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

57、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

58、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

59、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

60、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

61、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

62、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

63、在一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna为pegrna，其包含逆转录模板。在一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含pegrna和sgrna，所述sgrna靶向基因编辑系统的编辑链并在未编辑链上引入切口，例如在pe3系统中。在一些实施方案中，包含所述向导rna的多核苷酸进一步包含u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含pegrna，第二多核苷酸包含sgrna，并且每个多核苷酸进一步包含u6启动子。

64、在本文所述的细胞的一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

65、在一个方面，本公开提供了一种细胞，其包含本文所述的载体。

66、在一些实施方案中，本文所述的细胞包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，

67、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

68、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

69、在本文所述的细胞的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna的至少一种包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

70、在本文所述的细胞的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna的至少一种包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

71、在一些实施方案中，本文所述的细胞包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，

72、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

73、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

74、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

75、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

76、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

77、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

78、在一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna为pegrna，其包含逆转录模板。在一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含pegrna和sgrna，所述sgrna靶向基因编辑系统的编辑链并在未编辑链上引入切口，例如在pe3系统中。在一些实施方案中，包含所述向导rna的多核苷酸进一步包含u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含pegrna，第二多核苷酸包含sgrna，并且每个多核苷酸进一步包含u6启动子。

79、在一些实施方案中，所述多核苷酸的至少一种包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

80、在本文所述的细胞的一些实施方案中，至少一个载体为aav载体。在本文所述的细胞的一些实施方案中，两个载体均为aav载体。

81、在本文所述的细胞的一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9切口酶（ncas9）。在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9n-h840a（seq id no: 23）、esp-cas9（seq id no: 17）、hifi-cas9（seq id no: 18）、lz3-cas9（seq id no: 19）、spcas9-ng（seq id no: 20）、sniper-cas9（seq id no: 21）、superficas9（seq id no:22）或dcas9（seq id no: 24）。

82、在一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文所述的多核苷酸。

83、在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

84、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

85、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

86、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述向导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

87、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述向导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

88、在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，

89、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

90、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

91、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

92、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

93、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

94、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

95、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna为pegrna，其包含逆转录模板。在一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含pegrna和sgrna，所述sgrna靶向基因编辑系统的编辑链并在未编辑链上引入切口，例如在pe3系统中。在一些实施方案中，包含所述向导rna的多核苷酸进一步包含u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含pegrna，第二多核苷酸包含sgrna，并且每个多核苷酸进一步包含u6启动子。

96、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

97、在一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文所述的载体。

98、在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，

99、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

100、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸。

101、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述向导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

102、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含一个或多个向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，至少一种所述向导rna包含逆转录模板。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含rna聚合酶iii启动子。在一些实施方案中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子。在一些实施方案中，第二多核苷酸进一步包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

103、在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含第一多核苷酸，所述第二载体包含第二多核苷酸，

104、其中，第一多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的n端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间，或者位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间；和

105、其中，第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no:1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述第二多核苷酸包含编码截短的cas9蛋白或其变体的序列，其中所述截短的cas9蛋白或其变体包含全长cas9蛋白或其变体的c端部分，所述全长cas9蛋白或其变体在分裂位点处分裂成两部分，其中所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 11的第三个与第四个氨基酸之间；并且，其中所述序列进一步编码位于所述截短的cas9蛋白或其变体的n端的半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸；和

106、其中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接；和

107、其中，第二多核苷酸进一步包含编码内含肽c端部分的序列，所述内含肽c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接；和

108、其中，所述内含肽n端部分和所述内含肽c端部分形成全长内含肽。

109、在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe-gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。在一些实施方案中，所述内含肽为rma。

110、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含向导rna或编码其的序列。在一些实施方案中，所述向导rna为pegrna，其包含逆转录模板。在一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含pegrna和sgrna，所述sgrna靶向基因编辑系统的编辑链并在未编辑链上引入切口，例如在pe3系统中。在一些实施方案中，包含所述向导rna的多核苷酸进一步包含u6启动子。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含pegrna，第二多核苷酸包含sgrna，并且每个多核苷酸进一步包含u6启动子。

111、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸包含编码具有酶活性的蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为逆转录酶或其功能片段。在一些实施方案中，所述逆转录酶为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（mmlv-rt）或其变体。在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

112、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，至少一个载体为aav载体。在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，两个载体均为aav载体。

113、在本文所述的试剂盒的一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9切口酶（ncas9）。在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9n-h840a（seq id no: 23）、esp-cas9（seq id no: 17）、hifi-cas9（seq id no: 18）、lz3-cas9（seq id no: 19）、spcas9-ng（seq id no: 20）、sniper-cas9（seq id no: 21）、superficas9（seq id no:22）或dcas9（seq id no: 24）。

114、在一个方面，本公开提供了一种在细胞中改变靶核酸的方法，所述方法包括将本文所述的组合物或试剂盒递送至所述细胞中。

115、在一个方面，本公开提供了一种在细胞中改变靶核酸的方法，所述方法包括：

116、向所述细胞提供编码cas9蛋白或其变体的n端部分的第一多核苷酸，

117、向所述细胞提供编码所述cas9蛋白或其变体的其余c端部分的第二多核苷酸，

118、向所述细胞提供向导rna，所述向导rna包含与所述靶核酸互补的间隔序列，

119、其中，所述细胞能够进行rna反式剪接和/或内含肽介导的蛋白质反式剪接，并且其中所述细胞表达完整的cas9蛋白或其变体；以及

120、其中，所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq id no: 1-10中的任一者的第二个与第三个氨基酸之间；或者，所述分裂位点位于全长cas9蛋白或其变体的seq idno: 11的第一个与第二个氨基酸之间，并且第二多核苷酸n端的前两个氨基酸被半胱氨酸和苯丙氨酸，或者半胱氨酸和色氨酸替换。

121、在本文所述的方法的一些实施方案中，第一多核苷酸进一步包含编码内含肽n端部分的序列，所述内含肽n端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的c端连接，并且第二多核苷酸进一步包含编码所述内含肽其余c端部分的序列，所述内含肽其余c端部分与编码所述截短的cas9蛋白或其变体的序列的n端连接。在一些实施方案中，所述内含肽选自mxe gyra、npu、ssp-dnab、ssp-gyrb和rma。

122、在一些实施方案中，所述具有酶活性的蛋白质为胞苷脱氨酶或其功能片段、腺苷脱氨酶或其功能片段，或者甲基化酶或其功能片段。

123、在一些实施方案中，至少一种所述多核苷酸进一步包含向导rna或编码其的序列。在本文所述方法的一些实施方案中，所述向导rna进一步包含逆转录模板。

124、在本文所述的方法的一些实施方案中，第一多核苷酸由第一载体提供，第二多核苷酸由第二载体提供。

125、在本文所述的方法的一些实施方案中，第一载体和第二载体为病毒载体。

126、在本文所述的方法的一些实施方案中，所述病毒载体选自腺病毒、慢病毒和腺相关病毒（aav）。

127、在本文所述的方法的一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9切口酶（ncas9）。在一些实施方案中，所述cas9蛋白或其变体为cas9n-h840a（seq id no: 23）、esp-cas9（seq id no: 17）、hifi-cas9（seq id no: 18或98）、lz3-cas9（seq id no: 19或97）、spcas9-ng（seq id no: 20）、sniper-cas9（seq id no: 21或99）、superficas9（seqid no: 22或100）、hypacas9（seq id no: 93）、cas9hf1（seq id no: 94）、evocas9（seq idno: 95）、spcas9（seq id no: 96）、espcas9(1.1)（seq id no: 101）、xcas9（seq id no:102）、spgcas9（seq id no: 103）、sprycas9（seq id no: 104）、cas9-ng（seq id no:105）、cas9-vrqr（seq id no: 106）、cas9-vrer（seq id no: 107）或dcas9（seq id no:24）。

128、在本文所述的方法的一些实施方案中，所述靶核酸在体内被改变。

129、在一些实施方案中，本文所述的方法在体内进行。