一种用于治疗V型成骨不全症的基因编辑系统及其应用

本公开属于基因治疗和再生医学领域，具体涉及一种基于crispr/cas9基因编辑技术修复v型成骨不全症（osteogenesis imperfecta type v，oi5）热点致病基因突变（

ifitm5基因c.-14c>t）的方法、组合物及其在制备用于治疗v型成骨不全症的产品中的应用。

背景技术：

1、oi5是一种罕见的常染色体显性遗传性骨病，主要由

ifitm5基因5'非翻译区中的特定点突变c.-14c>t引起[1，2]。该突变产生一个新的上游起始密码子，导致所编码的骨限制性膜蛋白bril的n端异常，延伸5个氨基酸（malep），从而引起骨脆性增加、反复骨折和进行性骨骼畸形（桡骨头脱位、前臂骨间膜钙化和肥厚性骨痂等）[3]。目前，oi5的临床管理仅限于对症支持治疗，如骨折固定、手术矫形及双磷酸盐类药物干预，无法根治病因[4，5]。全球几乎所有已报道oi5患者均为突变ifitm5: c.-14c>t的杂合子，所以针对该突变位点开发通用型基因治疗策略，具备不可替代的临床价值与商业化前景。

技术实现思路

1、grna

2、鉴于本领域的需求，本公开提供了一种grna，其中所述grna靶向

ifitm5基因c.-14c>t突变位点。

3、grna是向导rna，是crispr/cas9系统中的核心rna分子，其5’端向导区可通过碱基互补配对特异性结合基因组目标dna位点，引导cas9核酸酶定点切割靶标dna。在本公开中，如无特别说明，grna尤其是指特异性结合靶标基因的区段。

4、靶标基因（也称靶基因、目的基因）指基因编辑、基因治疗、核酸药物研发中，待结合或切割或需要校正或调控的目标基因，是核酸分子（grna、sirna、反义核酸等）特异性识别结合的靶点。本公开中的靶标基因为

ifitm5基因或其片段，尤其是c.-14c>t致病点突变。

5、在一些实施方案中，所述grna包含或是seq id no：48所示。

6、基因编辑系统

7、本公开提供了一种用于修复

ifitm5基因c.-14c>t突变的基因编辑系统，其包含：

8、1）前述grna；

9、2）cas9蛋白。

10、本公开还提供了一种用于修复

ifitm5基因c.-14c>t突变的基因编辑系统，其包含：

11、1）前述grna的表达载体；

12、2）cas9蛋白的表达载体。

13、在一些实施方案中，本公开的基因编辑系统还任选包含供体模板，其提供正常的

ifitm5基因片段。

14、供体模板是携带野生型正常

ifitm5基因序列的核酸片段。细胞发生cas9介导dna双链断裂后，通过同源定向修复hdr机制，以该模板替换突变碱基，实现突变的精准修复。

15、对于供体模板的最短长度要求，没有绝对的数值限制，其下限通常由同源臂长度决定，不同类型供体存在差异。对于单链寡核苷酸供体：理论上，单侧30 nt同源臂，左右各30 nt通常认为可发生识别；实验室大多采用的下限为单侧35至40 nt（左右各35 nt，合计70 nt同源序列），在绝大多数细胞系就可以稳定编辑。合成上限一般200 nt以内。对于线性dsdna：最低可观测的下限为单侧50 bp同源臂（左右各50 bp）。对于环状质粒供体，最低有效同源臂单侧300 bp，常规实验通常采用单侧 600–900 bp。

16、在本公开的一个具体实施方案中，对于修复单碱基突变，功能性供体模板最低长度70至80 nt（左或右同源臂不少于30nt，优选不少于35 nt）。

17、在本公开的一个具体实施方案中，最短供体模板例如但不限于是seq id no: 47所示。

18、在一些实施方案中，所述供体模板至少包含seq id no：44所示的寡核苷酸中第35至95位、第34至95位、第33至95位、第32至95位、第31至95位、第30至95位、第29至95位、第28至95位、第27至95位、第26至95位、第25至95位、第24至95位、第23至95位、第22至95位、第21至95位、第20至95位、第19至95位、第18至95位、第17至95位、第16至95位、第15至95位、第14至95位、第13至95位、第12至95位、第11至95位、第10至95位、第9至95位、第8至95位、第7至95位、第6至95位、第5至95位、第4至95位、第3至95位、第2至95位、第1至95位。

19、在优选的具体实施方案中，供体模板长95 bp。供体模板为单链寡核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotides, ssodn），其序列如seq id no: 44所示。

20、在一些实施方案中，所述供体模板至少包含seq id no：44所示的寡核苷酸。

21、在一些实施方案中，所述grna表达载体和所述cas9表达载体处于同一载体，即单载体系统。

22、作为一个示例，一个载体上排布两套独立转录元件：第一启动子（如但不限于cmv、ef1α）启动cas9编码序列，表达cas9蛋白；第二启动子（如但不限于u6/h1）启动grna，转录向导rna。单载体系统仅需转染或转化一种质粒，操作简单、转染效率更高；cas9与grna同步，编辑效率稳定。但是，质粒骨架更大，大片段插入难度上升，无法单独调整cas9或grna用量，二者比例固定。

23、在一些实施方案中，所述grna表达载体和所述cas9表达载体是各自独立的载体，即双载体系统（cas9载体、grna载体分开两个质粒）。

24、作为一个示例，第一表达载体仅含cas9表达盒，第二表达载体仅含grna转录盒。两种质粒共转细胞。双载体系统中可灵活调控两者比例以优化敲除效率、降低脱靶；病毒包装容量更友好。但是，共转两种质粒，细胞同时摄取两种载体的效率会下降；两种载体拷贝数不均衡时，cas9和grna配比失衡，可能降低编辑活性。

25、无论是单载体系统，还是双载体系统，技术人员都可以根据现有技术进行选择和调整。

26、cas9是本领域常见的，且可以市售获得。作为一些示例，所述cas9蛋白例如但不限于spcas9、hifi cas9、espcas9(1.1)、spcas9-hf1、spcas9-hf2、cjcas9、evocas9、hypacas9、micas9、nmcas9、st1cas9、st2cas9、tdcas9、fncas9、sniper-cas9、superfi-cas9、spcas9-ng、spcas9-vqr、spcas9-vrer、spcas9-eqr、spcas9-d1135e、xcas9、sprycas9、sacas9、sacas9-hf、sccas9、kkh-sacas9、spcas9切口酶变体d10a、spcas9切口酶变体h840a、spcas9切口酶变体d10a+h840a。在具体的实施例中，采用了hifi cas9高保真cas9。

27、cas9和grna的表达载体是本领域常见的，且可以市售获得。作为一些示例，表达载体选自但不限于：px330、px458、lenticrispr v2、lenticas9-blast、lentiguide-puro、pspcas9(bb)-2a-gfp。px330（px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9）是一种all-in-one单质粒载体（cas9、grna在同一个载体）；px458（pspcas9(bb)-2a-gfp）包含来自酿脓链球菌的cas9带有2a-增强型绿色荧光蛋白，同时包含用于单导向rna的克隆骨架。技术人员可以选择适当的现有技术载体，只要在靶细胞中具有cas9和grna表达功能即可。

28、在一些实施方案中，所述基因编辑系统中的供体模板是双链寡核苷酸。

29、制药用途

30、本公开提供了前述grna在制备药物中的用途，所述药物用于治疗v型成骨不全症。

31、本公开还提供了前述基因编辑系统在制备药物中的用途，所述药物用于治疗v型成骨不全症。

32、本公开的药物可方便地以单位剂型呈现。包括将活性成分与可药用赋形剂关联的步骤。通常，本公开的药物可配制为任何适当的剂型，例如但不限于注射剂等。

33、修复基因的方法

34、本公开还提供了一种修复

ifitm5基因c.-14c>t突变的体外方法，包括步骤：

35、1）提供前述用于修复

ifitm5基因c.-14c>t突变的基因编辑系统，

36、2）将所述基因编辑系统导入靶标细胞。

37、基因编辑系统（cas9/grna/供体 dna）可用的基因导入方法包括但不限于：化学转染、病毒递送、物理转染、微生物介导。

38、化学转染的示例包括：

39、·脂质体转染：阳离子脂质包裹质粒dna形成脂质复合物，通过细胞膜内吞进入细胞。

40、·磷酸钙共沉淀转染：dna与ca3(po4)2形成微小沉淀颗粒，被细胞吞噬。

41、·pei聚乙烯亚胺转染。

42、病毒载体递送的示例包括：慢病毒，如lenticrispr系列载体；腺病毒；腺相关病毒；逆转录病毒。

43、物理导入的示例包括：电穿孔；显微注射；基因枪；超声转染；激光转染。

44、在一些实施方案中，所述靶标细胞携带

ifitm5基因c.-14c>t突变。

45、在一些实施方案中，所述靶标细胞来源于v型成骨不全症的受试者。

46、在一些实施方案中，所述靶标细胞是ipsc的形式。ipsc（诱导多能干细胞），将患者体细胞通过重编程因子诱导获得的多能干细胞，具备无限增殖、三胚层分化潜能，可体外定向分化为成骨细胞，是遗传性骨病基因修复的细胞载体。

47、在导入靶标细胞之前，所述靶标细胞被诱导为ipsc。

48、在一些实施方案中，本公开的方法还包括步骤：

49、3）将步骤2）所得细胞进行间充质干细胞诱导；

50、4）将步骤3）所得细胞进行成骨诱导分化。

51、基因修复后的ipsc诱导分化为间充质干细胞，间充质干细胞进一步定向成骨诱导分化，获得功能性成骨细胞。ipsc诱导方法、ipsc向间充质干细胞的分化方法、成骨诱导分化方法均是本领域熟知的。作为一个示例，通过含甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松的诱导培养基处理msc，使其定向分化为能够矿化、合成骨基质的成熟成骨细胞。

52、在一些实施方案中，所述grna：所述cas9蛋白的摩尔比为1:1至5:1，优选2:1。

53、在一些实施方案中，所述grna表达载体：所述cas9表达载体的摩尔比为1:1至5:1，优选2:1。

54、在一些实施方案中，孵育所述grna和所述cas9蛋白能够形成复合物。

55、在一些实施方案中，孵育所述grna表达载体表达的grna和所述cas9表达载体表达的cas9能够形成复合物。

56、在一些实施方案中，在导入靶标细胞前，所述基因编辑系统中的grna和cas9蛋白先形成复合物，再将复合物导入靶标细胞。

57、在另一些实施方案中，所述grna表达载体和所述cas9表达载体导入靶标细胞前，进入细胞后表达载体所表达的grna和cas9蛋白在靶标细胞内形成复合物。

58、在一些实施方案中，所述供体模板：所述复合物的摩尔比为1:1至10:1，优选5:1。

59、在一些实施方案中，每1×106个所述ipsc接触2μg至5 μg所述复合物和1μg至3μg所述供体模板。

60、在具体的实施方案中，每1×106个所述ipsc接触3μg所述复合物和2 μg所述供体模板。