TasR蛋白优化突变体及其基因编辑应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种tasr蛋白优化突变体及其基因编辑应用。

背景技术：

1、rna引导核酸酶（如crispr-cas9、cas12等）已被广泛应用于基因组工程。然而，其治疗应用受到两大限制：一方面，多数核酸酶依赖pam/tam识别序列，可靶向的基因组位点有限；另一方面，cas9、cas12a及其衍生变体体积过大，超出单个腺相关病毒载体的包装容量，导致体内递送困难。无pam的spry等cas9变体虽几乎消除了pam限制，但仍基于大体积cas9蛋白，单aav递送受限；而cas12f、cas12j、iscb、tnpb、fanzor等迷你核酸酶虽然体积紧凑，但大多仍依赖pam/tam，且需要大量工程改造才能在哺乳动物细胞中达到可用的编辑活性。

2、tigr-tas系统是一类新发现的紧凑型rna引导核酸酶。tigr阵列加工产生短的串联间隔向导rna（tigrna），通过串联间隔靶向机制识别dna；tasr（约340个氨基酸）包含nop结构域（rna结合结构域rbd，结合向导rna）、ruvc催化结构域以及c端卷曲螺旋二聚化结构域，通过两个ruvc结构域产生交错双链断裂，且无需pam。尽管野生型tasr具有无pam依赖、体积紧凑等优点，但其在哺乳动物细胞中的编辑活性很低。因此，亟需一种编辑活性显著提高、同时保持无pam依赖与紧凑体积的tasr蛋白突变体，以满足单aav包装与体内基因编辑的应用需求。

技术实现思路

1、针对野生型partasr在哺乳动物细胞中编辑活性低的问题，本发明通过对partasr全蛋白进行深度突变扫描，解析其序列-功能图谱，鉴定位于蛋白-核酸界面的关键增益突变位点，提供了一种编辑活性显著提高、同时保持无pam依赖与紧凑体积的tasr蛋白突变体，使其满足单aav包装与体内基因编辑的应用要求。

2、本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种tasr蛋白优化突变体，所述tasr蛋白优化突变体相对于seq idno.1所示的野生型tasr蛋白具有一个或多个氨基酸替换；

4、所述氨基酸替换选自e217w、e217f、e217y、q239f、q239w、l256r、d276q、d276h、s280k或s280r。

5、本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码中所述的tasr蛋白优化突变体。

6、优选地，所述核酸分子为dna或rna。

7、本发明第三方面提供了一种表达盒，所述表达盒含有所述的核酸分子；

8、所述表达盒中还有启动子。

9、优选地，所述启动子包括u6启动子和ef1α启动子中的至少一种。

10、本发明第四方面提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包含所述的表达盒；

11、所述基因编辑系统中还有向导rna。

12、本发明第五方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述的基因编辑系统。

13、优选地，所述重组表达载体的出发载体为paav8载体。

14、本发明第六方面提供了一种所述的tasr蛋白优化突变体、所述的核酸分子、所述的表达盒、所述的基因编辑系统和/或所述的重组表达载体的应用，所述应用是指以下中的任意一种：

15、1）制备基因编辑的产品；

16、2）制备基因治疗的药物。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明通过对partasr全蛋白进行深度突变扫描，鉴定出位于蛋白-核酸界面的关键增益突变位点，所获得的tasr蛋白突变体在保持无pam依赖和约340个氨基酸紧凑体积的同时，编辑活性显著提高。单点突变即可使编辑活性较野生型提高2.53～3.53倍，组合突变可提高至10倍左右。其中，优选组合突变体p3.5在所有测试剂量下活性最高，在

cxcr4位点编辑活性为野生型的约5.81倍，在

b2m位点约9.07倍。该突变体仍保持tasr无pam依赖、约340个氨基酸的紧凑体积，其二聚体也小于多数rna引导核酸酶，可与tigrna共包装入单个aav载体，满足体内递送要求。在体内应用中，经单aav8递送可高效编辑pcsk9基因。单aav8递送后肝组织indel约25.36%，循环pcsk9降低约82%、ldl-c降低约47%。因此，本发明为高胆固醇血症等疾病的体内基因编辑治疗提供了高效、紧凑的tasr突变体及基因编辑系统。

1.一种tasr蛋白优化突变体，其特征在于，所述tasr蛋白优化突变体相对于seq idno.1所示的野生型tasr蛋白具有一个或多个氨基酸替换；

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的tasr蛋白优化突变体。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求2所述的核酸分子；

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述启动子包括u6启动子和ef1α启动子中的至少一种。

5.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包含权利要求3所述的表达盒；

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求5所述的基因编辑系统。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为paav8载体。

8.权利要求1所述的tasr蛋白优化突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达盒、权利要求5所述的基因编辑系统和/或权利要求6所述的重组表达载体的应用，其特征在于，所述应用是指以下中的任意一种：