一种基于prdx5和irf3双基因编辑创制耐低氧草鱼的方法及应用与流程

本技术涉及水产生物育种，具体涉及一种利用crispr/cas12系统同时敲除prdx5和irf3基因并结合草鱼胚胎培育与养护方法创制耐低氧草鱼新种质的方法及应用。

背景技术：

1、草鱼（ctenopharyngodon idella）是我国养殖产量最高的淡水经济鱼类，在保障优质动物蛋白供给、改善国民膳食结构中发挥着不可替代的作用。然而，随着高密度集约化养殖模式的推广，养殖水体溶氧不足的问题日益突出。夏季高温季节池塘溶氧常降至2 mg/l以下，远低于草鱼正常生长所需的4~5 mg/l，导致摄食下降、免疫力降低、生长停滞，严重时引发大面积缺氧死亡。因此，培育耐低氧的草鱼新种质，是从根本上解决低氧胁迫问题的有效途径。

2、传统耐低氧育种主要依赖种内选择或杂交选育，但草鱼性成熟周期长达4~5年，世代间隔长，加之耐低氧性状属于多基因控制的复杂数量性状，传统育种效率极低，迄今尚无耐低氧草鱼审定品种问世。近年来，crispr/cas基因编辑技术的发展为鱼类精准分子育种提供了革命性工具。现有研究已成功利用crispr/cas9系统对草鱼多个性状相关基因进行编辑，如敲除pi4kb获得抗出血病兼速生草鱼、敲除runx2b获得无肌间刺草鱼、敲除mstnb获得快速生长草鱼等，证明了基因编辑技术在草鱼种质创制中的巨大潜力。

3、然而，目前针对草鱼耐低氧性状的基因编辑研究尚属空白。低氧应答是一个复杂的生理过程，涉及活性氧清除、炎症调控、代谢重塑等多条信号通路。已有的鱼类低氧应答调控机制研究表明，抗氧化酶系统和免疫应激通路在低氧响应中均发挥着重要作用。过氧化物还原酶5（peroxiredoxin 5,prdx5）是一种重要的抗氧化酶，能够清除细胞内过多的活性氧（ros），在低氧条件下对维持细胞氧化还原平衡具有保护意义；干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,irf3）是天然免疫信号通路中的关键转录因子，近年研究发现其不仅响应病毒感染，还能感知低氧诱导的线粒体损伤信号。然而，上述两个基因在低氧应答中的具体调控作用尚不完全清楚，如何通过遗传操作手段对草鱼的低氧应答能力进行改良，是本领域尚未解决的技术难题。

4、尽管现有技术在斑马鱼等模式生物中已开展过单基因敲除研究，但将这一基因功能知识从斑马鱼直接移植到草鱼育种实践，面临着多项实质性技术困难，绝非简单的物种间套用。首先，显微注射操作难度差异显著，斑马鱼受精卵卵膜薄而透明、注射窗口期长且死亡率低，而草鱼受精卵卵膜厚且粘性强、注射窗口期仅20~30分钟、注射后死亡率高达80%~95%，需要对注射压力、针尖直径、注射体积等参数进行系统性重新优化，无法直接套用斑马鱼的操作参数；其次，育种周期与遗传筛选难度悬殊，斑马鱼性成熟仅需3个月、从注射到获得f1代纯合突变体仅需4~6个月，而草鱼性成熟需4~5年、从f0代注射到获得f2代稳定遗传种质需8~10年以上，实验周期是斑马鱼的20倍以上，必须在f0代就实现高效编辑且嵌合体直接具备显著表型，否则数年的培育投入将付诸东流；此外，草鱼个体大、耗氧高、低氧胁迫实验需要更大的样本量和更长的实验周期。更为关键的是，现有的单基因编辑方案无法在草鱼上实现稳定且显著的耐低氧表型，而本领域尚缺乏将两个限制性调控基因进行协同敲除以解除双重抑制、从而充分激活低氧适应性通路的技术启示。

5、在基因编辑工具选择上，crispr/cas12a（又称cpf1）系统是继cas9之后的第二代基因编辑工具。与cas9相比，cas12a具有以下独特优势：（1）识别富含t的pam序列（tttv），扩展了可编辑基因组范围；（2）切割后产生黏性末端，有利于hdr修复，降低脱靶风险；（3）自身具有rnase活性，可自主加工crrna，适合多基因编辑时只需一条短crrna阵列即可实现多重编辑，极大简化了操作流程。然而，在草鱼中尚未有采用crispr/cas12系统进行多基因编辑的报道，其在草鱼受精卵中的编辑效率、对胚胎成活率的影响等关键参数均属未知。

6、综上所述，如何针对草鱼自身生物学特性，克服从斑马鱼到草鱼的技术跨越困难，建立一套能够实现双基因高效编辑并配套高成活率胚胎培育的技术方案，从而创制耐低氧草鱼新种质，是本领域亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术的目的在于提供一种基于crispr/cas12系统同时编辑prdx5和irf3基因创制耐低氧草鱼新种质的方法及应用。本技术针对草鱼自身生物学特性，在克服从斑马鱼到草鱼显微注射操作、育种周期和遗传筛选等技术跨越困难的基础上，首次将crispr/cas12系统应用于草鱼多基因编辑，通过设计靶向prdx5和irf3基因的sgrna，与cas12a蛋白混合后显微注射至草鱼单细胞期受精卵中，实现两个基因的同时敲除，并配套建立了一套完整的基因编辑后胚胎高成活率培育方法，从而稳定获得耐低氧能力显著增强的草鱼新种质。本技术方法操作简便、编辑效率高，所获双基因编辑草鱼嵌合体在低氧胁迫下的存活率显著高于野生型及单基因编辑草鱼嵌合体，为拓展低氧水域养殖空间、提高集约化养殖效益提供了有效的技术手段和种质资源。

2、为达到上述目的，本技术提供了如下技术方案：

3、第一方面，本技术提供了一种基于crispr/cas12系统编辑prdx5和irf3基因创制耐低氧草鱼种质的方法，包括以下步骤：

4、设计靶向草鱼prdx5基因和irf3基因的sgrna；

5、将所述sgrna与cas12a蛋白混合配制成注射混合液；

6、将所述注射混合液显微注射至草鱼单细胞期受精卵中；通过cas12a蛋白对靶基因进行剪切，实现prdx5和irf3基因的同时敲除。

7、对注射后的受精卵进行孵化培育，所述孵化培育包括静水孵化和出膜后仔鱼培育；

8、对孵化后获得的草鱼幼鱼进行双基因编辑阳性个体筛选，获得prdx5和irf3双基因敲除的草鱼f0代嵌合体。

9、在某些实施方式中，所述靶向prdx5基因的sgrna的靶向序列为：prdx5-sgrna：5’–tttgcctttaaagagttcagctattga–3’（seq id no:1）；所述靶向irf3基因的sgrna的靶向序列为：irf3-sgrna：5’–tttagcattccctggaagcatgctttg–3’（seq id no:2）。

10、在某些实施方式中，所述prdx5基因的sgrna靶位点位于其第二外显子，所述irf3基因的sgrna靶位点位于其第一外显子。

11、在某些实施方式中，所述sgrna的体外合成方法包括：

12、分别以核苷酸序列如seq id no:3所示的sgrna上游引物和核苷酸序列如seq idno:4所示的带有t7启动子的特异性包含prdx5靶位点的sgrna下游引物进行pcr扩增，以及以核苷酸序列如seq id no:3所示的sgrna上游引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的带有t7启动子的特异性包含irf3靶位点的sgrna下游引物进行pcr扩增，获得分别靶向prdx5基因和irf3基因的dna模板；以所述dna模板分别进行体外转录；采用氯化锂沉淀法分别纯化回收靶向prdx5基因和靶向irf3基因的sgrna。

13、在某些实施方式中，所述注射混合液中，prdx5基因sgrna和irf3基因sgrna的终浓度均为300 ng/μl，cas12a蛋白的终浓度为400 ng/μl，并加入终浓度为0.2%（w/v）的酚红作为指示剂。

14、在某些实施方式中，所述显微注射在人工授精完成后5~40分钟内、受精卵处于单细胞期时进行。

15、在某些实施方式中，所述静水孵化包括：将注射后的受精卵置于孵化容器中静水孵化，控制孵化水温为25~28 ℃，孵化用水溶氧为6~7 mg/l、ph为7.5~8.0，氨氮<0.02 mg/l，亚硝酸盐<0.01 mg/l，无污染，敌害生物为零；每4~6小时换水一次并同步吸除死卵和代谢废物。

16、在某些实施方式中，所述静水孵化还包括水霉菌防控措施：换水时挑除死卵；发现霉菌滋生时加入亚甲基蓝溶液药浴；保持孵化水温恒定。

17、在某些实施方式中，所述出膜后仔鱼培育包括：出膜后仔鱼静水暂养至平游，平游后转入培育水槽继续培育。

18、在某些实施方式中，所述双基因编辑阳性个体筛选包括：提取草鱼幼鱼尾鳍基因组dna，对prdx5基因和irf3基因的靶位点区域进行pcr扩增和测序分析，靶位点处测序结果出现双峰的个体即为双基因编辑阳性的草鱼f0代嵌合体。

19、第二方面，本技术提供了第一方面所述方法在草鱼耐低氧种质创制或低氧水域草鱼养殖中的应用。

20、与现有技术相比，本技术至少具备以下有益效果：

21、1.本技术首次在草鱼中实现了基于crispr/cas12系统的prdx5和irf3双基因高效敲除，并成功获得了耐低氧表型显著增强的草鱼f0代嵌合体。低氧胁迫实验表明，双基因敲除嵌合体在低氧条件下的存活率显著优于野生型及任一单基因敲除嵌合体，填补了草鱼耐低氧分子育种的空白。本技术通过crispr/cas12a系统配合靶向prdx5基因第二外显子和irf3基因第一外显子的sgrna，克服了从斑马鱼到草鱼在显微注射操作、育种周期和遗传筛选等方面的技术跨越困难，为基因编辑技术在草鱼及其他经济鱼类育种中的应用提供了可行路径。

22、2.本技术建立了一套完整的草鱼基因编辑后胚胎高成活率培育方法，有效降低了显微注射后草鱼胚胎的死亡率，解决了因注射后胚胎大规模死亡而难以获得足够数量f0代个体的技术瓶颈，为基因编辑技术在草鱼育种中的规模化应用提供了重要的配套技术支撑。荧光定量pcr结果显示，双基因敲除嵌合体各组织中耐低氧相关通路基因pgk1的表达量均极显著高于野生型及单基因敲除组，证明了双基因敲除的协同效应并非两个单基因效应的简单叠加，确认了prdx5/irf3双基因组合作为草鱼耐低氧抗逆育种优选靶点的科学基础。