一种增强TD-PE基因编辑的组合物及用途

本发明属于基因编辑与分子生物学，具体涉及一种增强td-pe基因编辑的组合物及用途。

背景技术：

1、串联重复是基因组结构变异的重要类型，与多种遗传性疾病及肿瘤的发生发展密切相关，建立能够在内源基因组中精准构建不同长度串联重复的编辑工具，有助于解析串联重复结构变异的形成机制、生物学功能和表型后果，串联重复引导编辑td-pe通过一对反式pegrna在待重复片段两侧产生具有互补同源序列的引导编辑单链dna，能够实现原位串联重复构建，因此提高td-pe在不同位点及不同重复片段长度条件下的编辑效率具有重要意义。

2、现有技术中存在的问题点：现有td-pe依赖两个反式pegrna产生的单链dna完成退火及内源修复整合，编辑中间体容易受到靶位点序列、重复片段长度和细胞修复状态的影响，不同内源基因组位点之间的编辑效率差异较大，尤其在大片段串联重复及疾病相关位点中容易出现有效编辑产物比例不足的问题，现有提高引导编辑器表达量及调整pegrna序列的处理难以直接改善串联重复中间体的稳定整合过程。

技术实现思路

1、为解决现有td-pe编辑中间体容易受到靶位点序列、重复片段长度和细胞修复状态影响，导致不同内源基因组位点之间编辑效率差异较大，并且大片段串联重复及疾病相关位点中有效编辑产物比例不足的问题，本发明提供一种增强td-pe基因编辑的组合物及用途。

2、本发明首先提供一种增强td-pe基因编辑的组合物，包括引导编辑器组分、反式pegrna对组分和aurora-b活性抑制组分。

3、引导编辑器组分包括编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸，ncas9为spcas9核酸酶h840a突变体，逆转录酶连接于ncas9的羧基端。

4、反式pegrna对组分包括pegrna1表达核酸和pegrna2表达核酸，pegrna1靶向待重复基因组片段的一侧，pegrna2靶向待重复基因组片段的另一侧，pegrna1的逆转录模板含有与pegrna2靶向区域对应的基因组同源序列，pegrna2的逆转录模板含有与pegrna1靶向区域对应的基因组同源序列。

5、aurora-b活性抑制组分包括kw-2449和显性负性aurora-b k106r突变体中的一种，显性负性aurora-b k106r突变体为aurora-b蛋白第106位赖氨酸替换为精氨酸形成的激酶失活突变体。

6、本发明发现，在td-pe组分进入目标细胞并形成能够相互退火的引导编辑单链dna期间降低aurora-b活性，能够提高串联重复编辑中间体完成退火和稳定整合的概率，该增强作用不依赖g2/m期细胞周期阻滞，并且主要作用于含基因组同源序列的td-pe及td-ae编辑系统。

7、在一些实施方案中，aurora-b活性抑制组分为kw-2449，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸和反式pegrna对组分先递送至目标细胞，递送12h至16h后加入kw-2449，kw-2449在目标细胞培养体系中的终浓度为1μm至10μm，处理时间为36h至60h。

8、在一些实施方案中，kw-2449在目标细胞培养体系中的终浓度为5μm，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸和反式pegrna对组分递送12h至16h后加入kw-2449，并继续培养48h。

9、在一些实施方案中，pegrna1表达核酸与pegrna2表达核酸的质量比为0.8∶1至1.2∶1，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸与两个pegrna表达核酸总量的质量比为1.5∶1至3∶1。

10、在一些实施方案中，aurora-b活性抑制组分为显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸、pegrna1表达核酸、pegrna2表达核酸和显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸在同一次转染过程中递送至目标细胞。

11、在一些实施方案中，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸、pegrna1表达核酸、pegrna2表达核酸和显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸的质量比为4∶1∶1∶2。

12、在一些实施方案中，组合物采用分装试剂盒形式，第一容器装有编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸，第二容器装有pegrna1表达核酸和pegrna2表达核酸，第三容器装有kw-2449或者显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸。

13、本发明进一步提供前述组合物在制备提高td-pe基因编辑效率的试剂中的用途。

14、在一些实施方案中，组合物提高含基因组同源序列的td-pe及td-ae编辑效率，组合物不对缺少基因组同源序列的ae编辑产生稳定增强作用。

15、在一些实施方案中，组合物应用于构建50bp至10kb的原位串联重复、构建疾病相关串联重复细胞模型、制备串联重复基因编辑试剂和分析串联重复结构变异对应的功能表型。

16、本发明有益效果如下：

17、（1）本发明利用aurora-b活性抑制组分与反式pegrna同源退火结构之间的协同作用，提高两个pegrna产生的引导编辑单链dna完成退火及稳定整合的概率，使kw-2449处理后的十二个内源基因组位点编辑效率平均提高1.92倍，解决原始td-pe在不同内源位点中的编辑效率不足问题。

18、（2）利用先递送td-pe组分再加入kw-2449的时序调控方式，使aurora-b抑制窗口与串联重复编辑中间体形成窗口相互重合，在提高编辑效率的同时未造成能够检测到的重复连接区编辑保真度下降，解决提前给药造成无效暴露及非特异性细胞周期干扰的问题。

19、（3）本发明利用显性负性aurora-b k106r突变体与ncas9-rt融合蛋白及反式pegrna对进行单次共递送，使td-pe荧光报告系统的编辑效率由2.89%提高至4.58%，五个内源基因组位点的编辑效率平均提高1.46倍，解决aurora-b小干扰rna需要重复转染并且沉默效果难以持续的问题。

1.一种增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，包括引导编辑器组分、反式pegrna对组分和aurora-b活性抑制组分；

2.根据权利要求1所述的增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，所述ncas9-rt融合蛋白包括spcas9核酸酶h840a突变体和连接于spcas9核酸酶h840a突变体羧基端的逆转录酶。

3.根据权利要求1所述的增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，所述pegrna1和pegrna2均包括间隔序列、骨架序列、引物结合序列和逆转录模板序列，pegrna1表达核酸与pegrna2表达核酸的质量比为0.8∶1至1.2∶1，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸与两个pegrna表达核酸总量的质量比为1.5∶1至3∶1。

4.根据权利要求1所述的增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，所述aurora-b活性抑制组分为kw-2449，kw-2449与编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸及反式pegrna对组分分别设置于独立容器中。

5.根据权利要求1所述的增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，所述aurora-b活性抑制组分为显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸，显性负性aurora-b k106r突变体为aurora-b蛋白第106位赖氨酸替换为精氨酸形成的激酶失活突变体，编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸、pegrna1表达核酸、pegrna2表达核酸和显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸的质量比为4∶1∶1∶2。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的增强td-pe基因编辑的组合物，其特征在于，所述组合物设置于分装试剂盒中，分装试剂盒包括第一容器、第二容器和第三容器，第一容器装有编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸，第二容器装有pegrna1表达核酸和pegrna2表达核酸，第三容器装有kw-2449或者显性负性aurora-b k106r突变体表达核酸。

7.权利要求1-6中任一项所述的组合物在制备提高td-pe及td-ae基因编辑效率的试剂中的用途，其特征在于，td-pe及td-ae的pegrna逆转录模板含有与目标基因组对应的同源序列。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述aurora-b活性抑制组分为kw-2449时，先将编码ncas9-rt融合蛋白的表达核酸、pegrna1表达核酸和pegrna2表达核酸递送至目标细胞，经过12h至16h后加入kw-2449，使kw-2449终浓度达到1μm至10μm并处理36h至60h，td-pe及td-ae在目标基因组中形成50bp至10kb的串联重复序列。