基于吡唑的DNA依赖性蛋白激酶抑制剂和组合物以及在基因编辑中的应用的制作方法

本公开一般涉及通过向真核细胞施用通式(i)的dna蛋白激酶(dna-pk)抑制剂和基因组编辑系统来提高基因组编辑效率的化合物、组合物、方法和试剂盒。本公开还涉及包含通式(i)的dna-pk抑制剂的组合物、将目标(interest)多核苷酸插入真核细胞基因组的方法以及用于将目标基因插入真核细胞基因组的试剂盒。这些方法和试剂盒可以改善crispr/cas-介导的多核苷酸在细胞中的插入效率，特别是在经crispr-改造的car-t细胞中。对序列表的引用并入本技术包含通过efs-web以.xml格式提交的序列表并且通过引用其整体并入本文。所述.xml副本创建于2025年1月30日，命名为055920-635001wo.xml，且大小为74kb。

背景技术：

1、开发具有成本效益和可靠的方法来精确靶向改变活细胞的基因组始终为长期的目标。基因组编辑有潜力消除导致特定障碍的基因(即基因“敲除”)，或者提供基因操纵或插入的手段，以便通过基因“敲入”纠正遗传缺陷或增强生物学过程。基因组编辑可应用于多种障碍的治疗，包括遗传性障碍、血液系统障碍和癌症的治疗，以及免疫治疗方法。成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)系统是原核免疫系统(ishino等人，journal of bacteriology 169:5429-5433 (1987))，其通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫性((soret等人, nature reviewsmicrobiology 6:181-186 (2008))。自其最初发现以来，多个研究小组已围绕crispr系统在遗传改造(genetic engineering)(包括基因编辑)中的潜在应用进行了广泛研究(jinek等人, science 337(6096):816-821 (2012)；cong等人, science 339(6121):819-823(2013)；以及mali等人, science 339(6121):823-826 (2013))。crispr-cas9基因编辑系统已成功应用于多种生物体和细胞系。

2、cas9内切核酸酶在靶序列(原型间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif,pam)的上游)处产生双链dna断裂。然后可以移除靶序列，或者可以使用细胞的内源性修复途径将目标序列插入靶序列中。内源性dna修复途径包括非同源介导的末端连接(nhej)途径、微同源介导的末端连接(mmej)途径和同源定向修复(hdr)途径。

3、nhej、mmej和hdr途径修复双链dna断裂，但此类双链dna断裂的修复可能导致在双链断裂位点处产生插入或缺失。在nhej中，修复dna断裂不需要同源模板。nhej修复可能容易出错，不过当dna断裂包括兼容的突出端(overhang)时，错误会减少。nhej和mmej是机制上不同的dna修复途径，其中每种途径均涉及不同的dna修复酶亚群。与nhej在某些情况下可能是精确的或在某些情况下容易出错不同，mmej总是容易出错的，并导致在修复位点处产生缺失和插入。mmej-相关缺失归因于双链断裂两侧的微同源性(2-10个碱基对)。相反，hdr需要同源模板来向导修复，但hdr修复通常是高保真且不易出错的。因此，由hdr驱动的双链dna断裂修复优于nhej或mmej介导的修复；然而，在许多细胞类型中，hdr在所有细胞周期阶段均受到nhej活性的限制，并且hdr主要用于细胞生长的s/g2期(mao等人, cellcycle, 7:2902-2906 (2008))。

4、随着crispr/cas9编辑技术的近期发现和实施，在精确位置修饰任何细胞基因组的能力已得到改善。然而，在给定位点引入特定定向变化的能力受到以下事实的阻碍：cas9介导的dna切割后发生的主要细胞修复途径是错误的非同源末端连接(nhej)途径。同源定向重组(hdr)的效率低于nhej，从而降低了真核细胞中的编辑效率。虽然在某些报道中，由nhej产生的插入或缺失(indels)的效率高达70%，但hdr的效率仍然具有挑战性，效率低于1%。因此，需要提高基因组编辑效率，特别是hdr效率。

5、研究表明，体内nhej活性的降低导致hdr活性的增加，并且可以利用这一现象来提高hdr介导的crispr/cas9精准基因组改造的效率(pierce等人, genes dev., 15, 3237–3242 (2001)；ma等人, rna biol., 13, 605–612 (2016)；maruyama等人, nat.biotechnol., 33, 538–542 (2015)；robert等人, genome med., 7, 93 (2015))。

6、dna依赖性蛋白激酶(dna-pk)是一种核丝氨酸/苏氨酸激酶，已被证明在dna双链断裂修复机制中至关重要。在哺乳动物中，修复双链dna断裂的主要途径是非同源末端连接(nhej)途径，该途径在细胞周期的各个阶段均有功能，并通过去除不可连接的末端并连接双链断裂的末端来起作用。需要有效且选择性的dna-pk抑制剂(dna-pki)来瞬时阻断nhej途径，从而通过期望的hdr途径促进dna修复，因此提高细胞(如crispr car-t细胞)中crispr/cas介导的多核苷酸插入的效率。

技术实现思路

1、本公开的第一个方面涉及式(i)的化合物

2、 (i)，

3、或其药学上可接受的盐，其中：

4、a是5元或6元杂芳基或杂环烷基，其含有至少一个选自n、o和s的杂原子，其中所述5元或6元杂芳基或杂环烷基任选地被一个或多个r3取代；其中所述5元或6元杂芳基或杂环烷基任选地被一个或多个r3取代；

5、r1是芳基或杂芳基，其含有至少一个选自n、o和s的杂原子，其中所述芳基或杂芳基任选地被一个或多个r4取代；

6、r2是h、c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、c2-c4烯基或c2-c4炔基，其中所述烷基任选地被一个或多个卤素、oh或-cn取代；

7、每个r3独立地选自卤素、氧代、硫代、c1-c4烷基、cd3、cd2cd3、c1-c4烷氧基、c1-c6卤代烷基、c3-c6环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基；或

8、两个偕位r3与介于中间的偕位碳原子一起形成c3-c5环烷基；

9、每个r4独立地选自卤素、氧代、nh2、oh、-cn、c(o)nhr6、c1-c4烷基、c2-c4烯基、c2-c4炔基、cd3、cd2cd3、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基、c3-c6环烷基、杂环烷基、杂芳基和芳基，其中所述烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基、杂环烷基、杂芳基或芳基任选地被一个或多个r5取代；

10、每个r5独立地选自卤素、oh、氧代、nh2、cho、c1-c4烷基和c1-c6烷氧基；

11、每个r6独立地是h或c1-c4烷基；以及

12、每个r7独立地是h、c1-c2烷基、cf2h、cf3、卤素或cn。

13、本公开的另一个方面涉及药物组合物，其包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体还可以包括赋形剂、稀释剂或表面活性剂。

14、本公开的另一个方面涉及组合物，其包含(a) dna蛋白激酶抑制剂(dna-pki)和(b) dna切割剂，其中所述dna-pki是式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体。

15、本公开的另一个方面涉及细胞中靶向基因组编辑的方法，包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体。

16、本公开的另一个方面涉及修复细胞基因组中双链dna断裂的方法，包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体。

17、本公开的另一个方面涉及通过非同源末端连接(nhej)途径抑制或阻止细胞中dna断裂修复的方法，包括使所述细胞与dna切割剂和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体。

18、本公开的另一个方面涉及将供体dna靶向插入细胞基因组的方法，包括使所述细胞与dna切割剂、供体dna和dna-pki接触，其中所述dna-pki是式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体或互变异构体。

19、本公开的另一个方面涉及式(i)的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或药物组合物在制备用于细胞疗法的药物中的用途。

20、本公开的另一个方面涉及式(i)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体、互变异构体或药物组合物在治疗细胞中的用途。

21、在一些方面，本公开提供了制备本公开化合物的方法。

22、在一些方面，本公开提供了制备化合物的方法，包括本文所述的一个或多个步骤。

23、本公开的其他特征和优点将从以下详细描述和权利要求书中变得显而易见。

24、附图简要说明

25、图1显示了电穿孔后5天，dna-pk抑制剂化合物对细胞活力的影响。活细胞以占总细胞的百分比表示。

26、图2显示了电穿孔后5天，dna-pk抑制剂化合物对t细胞增殖的影响。显示了总活细胞计数(×10e6)。

27、图3显示了电穿孔后5天，dna-pk抑制剂化合物对car插入trac基因座的影响。car+t细胞的频率以占总活细胞的百分比表示。

28、图4显示了电穿孔后5天，dna-pk抑制剂化合物对car插入trac基因座的影响。ki效率表示为相对于未处理对照条件的变化倍数(未处理为1)。

29、图5显示了电穿孔后5天，dna-pk抑制剂化合物对总car+细胞产率的影响。相对car+产率表示为相对于未处理对照条件的倍数变化(未处理为1)。