一种糖基转移酶AaUGT的突变体及其应用

本发明属于生物合成，具体涉及到一种糖基转移酶aaugt的突变体及其应用。

背景技术：

1、漆黄素（fisetin），又称非瑟酮，化学名为3,3',4',7-四羟基黄酮，属于类黄酮类亚群中的多酚，是典型的林源黄酮类化合物，其主要存在于漆科植物木蜡树，以及草莓、黄瓜、猕猴桃等果蔬中。现代药理学研究表明，漆黄素对神经系统健康并发症和神经退行性疾病，如阿尔兹海默病、帕金森病等具有潜在益处；漆黄素还可以显著抑制肿瘤细胞（如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等）增殖；同时，漆黄素还具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗凝血、抗血栓、治疗糖尿病肾损伤等多种生物活性。因此，漆黄素在食品、化妆品、医药等领域应用潜力巨大。由其结构可知，漆黄素是一种多酚羟基类化合物，亲脂性差；同时，酚羟基间易形成较强的分子间作用力致其晶格能较高，水溶性也较差。导致漆黄素在实际使用过程中存在吸收差、生物利用度低、疗效差等问题，严重阻碍了人们对其进行深度开发和应用。

2、糖基化修饰作为天然化合物结构修饰的重要途径之一，在提升化合物物化特性和药理活性方面有着显著优势，不仅显著提高目标分子的溶解性和化学稳定性，更能够通过分子构象调节增强其在生物体内的吸收效率和代谢稳定性，从而提升目标分子的药用价值。在黄酮类化合物的结构中，c环的3-oh是一个关键且活泼的药效团，对3-oh进行糖基化修饰，能够显著改善分子的水溶性和化学稳定性；其次，所形成的3-o-糖苷键是体内多种糖苷酶的常见底物，易于被特异性水解，从而可控地释放出活性原形药物，使其成为理想的前药设计位点。

3、然而，天然的漆黄素-3-o糖苷在植物中的含量低（＜0.01%），且提取工艺步骤繁琐、收率低；而化学合成法依赖于氰化钠等有毒试剂且存在区域选择性差等缺点，导致环境危害及经济成本较高等缺陷。近年来，酶法糖基化技术因其绿色、高效以及可调控性、专一等优势，已成为糖基化修饰领域的一项突破性解决方案。然而，目前天然糖基转移酶的专一性、催化效率不能满足定向制备漆黄素-3-o-葡萄糖苷的需求，其存在的主要瓶颈问题是：已有糖基转移酶对漆黄素的底物特异性和区域选择性不强，不能特异性作用于漆黄素的特定位点3-oh上，且催化活性低。

4、常规黄酮糖基化改性多采用化学合成手段，存在反应位点难控、区域选择性差、副产物繁多、分离纯化困难、反应条件苛刻、环境负担重、生产成本高等诸多弊端，无法实现漆黄素-3-o-葡萄糖苷的绿色、定向、高效制备。现有技术中，天然糖基转移酶普遍存在催化效率低、底物谱窄、区域选择性不佳的问题，加之胞内糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖（udpg）合成匮乏、供给不足，进一步导致漆黄素糖基化产物产量低、转化效率差，难以满足规模化生产需求。业内已研发筛选获得的糖基转移酶，却难以突破制备漆黄素-3-o-葡萄糖苷技术瓶颈，无法兼顾高催化活性、精准区域选择性与高产物得率。

5、因此，急需突破漆黄素糖基化过程中存在的区域选择性差、催化效率低这一瓶颈。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、本发明的其中一个目的是提供一种糖基转移酶aaugt的突变体，通过克隆一个来源于

arabis alpina的新型糖基转移酶aaugt，通过定点改造，提升了该酶的转化率，并实现了该酶在大肠杆菌中的高效异源表达。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种糖基转移酶aaugt的突变体，所述双突变体是将来源于高山南芥（

arabis alpina）gt 1家族的糖基转移酶aaugt的氨基酸序列进行以下（a）~（b）中任何一种的取代：

5、（a）将第314位的赖氨酸替换为苯丙氨酸；

6、（b）将第314位的赖氨酸替换为苯丙氨酸，且将第284位的苯丙氨酸替换为酪氨酸；

7、其中，所述糖基转移酶aaugt的氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、作为本发明糖基转移酶aaugt的突变体的一种优选方案，其中：进行（a）所示的取代的突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示；

9、进行（b）所示的取代的突变体的氨基酸序列如seq id no.6所示。

10、本发明的另一个目的是提供编码如上所述糖基转移酶aaugt的突变体的基因，进行（a）所示的取代的突变体的核苷酸序列如seq id no.3所示；

11、进行（b）所示的取代的突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示。

12、本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如上所述的基因。

13、作为本发明重组表达载体的一种优选方案，其中：所述重组质粒的载体选自pgex-4t、pet28a与pmal-c2x中的一种；优选pgex-4t。

14、本发明的另一个目的是提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包含如上所述的重组表达载体或将所述重组表达载体整合到基因组上。

15、作为本发明重组工程菌的一种优选方案，其中：所述重组工程菌包括大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌中的一种。

16、作为本发明重组工程菌的一种优选方案，其中：所述重组工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌bl21(de3)、mg1655(de3)和jm109(de3)中的一种。

17、作为本发明重组工程菌的一种优选方案，其中：所述重组工程菌中还过表达外源udpg合成途径相关基因，包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

zwf、葡萄糖-6-磷酸异构酶

pgi、尿苷二磷酸糖水解酶

usha、磷酸葡萄糖变位酶

pgm、尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶

ugpa，udp-葡萄糖焦磷酸化酶

galu、葡萄糖激酶

glk、葡萄糖转运磷酸转移酶

ptsg、核苷激酶

udk中的一种或多种。

18、本发明的另一个目的是提供如上所述的糖基转移酶aaugt的突变体在转化漆黄素制备漆黄素-3-o-葡萄糖苷中的应用。

19、作为本发明糖基转移酶aaugt的突变体在转化漆黄素制备漆黄素-3-o-葡萄糖苷中的应用的一种优选方案，其中：所述应用为糖基转移酶aaugt的突变体在体外酶促转化漆黄素；以漆黄素为底物，目标产物为漆黄素-3-o-葡萄糖苷，反应温度为30~40℃，ph为6.5~9.0，漆黄素底物终浓度为1 mm，重组糖基转移酶aaugt添加量为0.1~0.5 u/ml，反应至底物转化完全。

20、作为本发明糖基转移酶aaugt的突变体在转化漆黄素制备漆黄素-3-o-葡萄糖苷中的应用的一种优选方案，其中：所述应用为糖基转移酶aaugt的突变体在体内生物催化转化漆黄素生成漆黄素-3-o-葡萄糖苷；将携带所述糖基转移酶aaugt的突变体基因的重组质粒与携带外源udpg合成途径相关基因的重组质粒共同转入大肠杆菌细胞中构建重组工程菌，iptg浓度为0~1 mm，诱导温度为16~37℃，发酵温度为20~40℃，采用麦芽糊精、甘油、葡萄糖、菊粉、糊精或麦芽糖中的一种或多种为碳源的tb培养基，麦芽糖浓度为0~25 g/l，纤维二糖浓度为0~25 g/l，漆黄素底物浓度为0.5~3 g/l。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、本发明从高山南芥（

arabis alpina）基因组中克隆获得新型糖基转移酶aaugt，相较于已有的糖基转移酶，该酶酶学性质优异，最适催化温度45℃、最适ph 7.5，在40~50℃、ph5.5~9.0范围内稳定性突出，适配多种催化场景，实用性大幅提升。

23、本发明对糖基转移酶aaugt进行糖基供体转化关键位点突变，并利用突变体精准靶向漆黄素3-oh位点催化糖基化，无副产物生成；集成强化udpg合成途径构建的重组工程菌，优化后摩尔转化效率达89.6%，产物滴度高达3.51 g/l，催化效率远超现有技术。酶法合成绿色温和、操作简便，既解决了漆黄素水溶性差、生物利用度低的应用短板，又避开了化学合成位点难控、污染重、成本高的弊端，为漆黄素糖苷及同类黄酮化合物的高效高值化利用提供了坚实技术支撑。