一种高稳定性莫奈林蛋白及其重组基因的制作方法

本发明涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种高稳定性莫奈林蛋白及其重组基因。

背景技术：

1、莫奈林（monellin）是一种从非洲西部热带雨林植物

dioscoreophyllum

cumminsii果实中发现的天然高倍甜味蛋白，于1969年被首次分离鉴定，其甜度约为蔗糖的3000倍，具有甜味纯净、热量极低、不参与血糖代谢等优良特性，在糖尿病和肥胖人群的食品开发中展现出广阔的应用前景。然而，天然莫奈林蛋白的热稳定性差严重制约了其商业化应用：该蛋白在天然状态下以异源二聚体形式存在，两条多肽链通过非共价键结合，在温度超过50℃时极易解聚变性，导致甜味活性丧失；在常规食品加工所需的热处理条件（如巴氏消毒72℃/15秒）下，莫奈林蛋白会发生不可逆的结构破坏和甜度损失，无法满足液态乳制品、果汁饮料等需要热杀菌产品的工艺要求。因此，提高莫奈林蛋白的热稳定性，开发能够耐受食品工业热加工条件的功能性甜味蛋白，已成为该领域亟待解决的关键技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种热稳定性增加的莫奈林蛋白突变体，该突变体可采用生物发酵法进行规模化生产。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种高稳定性莫奈林蛋白，其初始序列如seq id no.1所示。该初始莫奈林蛋白序列来源于蛋白序列文库genbank:aff58925.1。利用lésign平台，对初始莫奈林蛋白进行序列设计，最终得到了计算层面上最优的酶变体。

3、一种高稳定性莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+f12h+q29k+i39v，得到如seq id no:2所示的莫奈林蛋白突变体。

4、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+r32k+r40k+m43i，得到如seq id no:3所示的莫奈林蛋白突变体。

5、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+f53e+q62f+y66e，得到如seq id no:4所示的莫奈林蛋白突变体。

6、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案： 一种莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+e49k+r54k+r73e，得到如seq id no:5所示的莫奈林蛋白突变体。

7、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+d75v+s77f+d79e，得到如seq id no:6所示的莫奈林蛋白突变体。

8、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白，所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的初始莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+n15e+e60i+r85k，得到如seq id no:7所示的莫奈林蛋白突变体。

9、本发明的目的之二在于提供一种可以表达上述莫奈林蛋白突变体的dna或rna。

10、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白的重组遗传物质，能够表达上述任意一项所述的莫奈林蛋白的dna或rna。

11、本发明的目的之三在于提供一种可以生产上述莫奈林蛋白的生产菌株。

12、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种莫奈林蛋白的生产菌株，含有上述重组遗传物质。

13、作为优选，上述生产菌株的底盘细胞为毕赤酵母。

14、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明改造后的莫奈林蛋白在甜度表现和稳定性方面均实现了显著提升，其甜度达到初始的1.5倍以上，甜味强度明显增强；同时不同食品的基质环境（如高酸度果汁的ph小于4.5）和消毒的条件（如有些食物需要进行超巴氏消毒）均存在差异。在ph4.5环境下经过125℃加热5秒后，初始莫奈林蛋白的甜度损失了大半，这会严重影响食物的品质。而改造后的莫奈林蛋白展现出卓越的耐受性，在相同方式加热消毒后其甜度基本保持不变，这一特性不仅确保了终端产品的风味品质，更为工业化生产中的标准化品控提供了可靠保障，有效拓展了莫奈林蛋白作为甜味剂在食品中的应用边界。

1.一种高稳定性莫奈林蛋白，其特征在于所述莫奈林蛋白以seq id no:1所述的莫奈林蛋白为母本，以下突变集进行突变：g84k+d75v+s77f+d79e。

2.一种高稳定性莫奈林蛋白的重组遗传物质，其特征在于能够表达如权利要求1所述的莫奈林蛋白的dna或rna。

3.一种高稳定性莫奈林蛋白的生产菌株，其特征在于含有如权利要求2所述的重组遗传物质。

4.根据权利要求3所述的一种高稳定性莫奈林蛋白的生产菌株，其特征在于所述生产菌株的底盘细胞为毕赤酵母。