提高茶树农杆菌渗透转化效率的方法及所用装置

本发明属于植物遗传工程与生物，具体涉及一种植物组织培养和遗传转化的方法和所用装置。

背景技术：

1、茶树（

camellia sinensis(l.) kuntze）是重要的经济作物，其新梢制成的茶叶是具有极高的经济价值。随着消费者对茶叶品质、风味及健康功能需求的日益提高，对茶树优良品种的选育提出了更高的要求。然而，茶树作为一种多年生木本植物，其传统的杂交育种方法面临着诸多固有的生物学限制。诸多因素共同导致传统育种周期长、效率低下，难以快速、定向地将抗病虫、优质、高产、特定代谢产物含量等优良性状聚合到单一品种中（文献1、2）。

2、为了突破传统育种的瓶颈，现代生物技术，特别是植物遗传转化技术，为茶树的遗传改良提供了全新的、高效的途径。通过遗传转化，可以将目标基因精准地导入茶树基因组中，从而在较短时间内实现对特定性状的定向改良。目前，应用于茶树的遗传转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪法。其中，农杆菌介导法因其操作相对简便、整合t-dna片段较为完整、单拷贝插入率较高等优点，成为植物遗传转化中最常用的方法（文献3、4）。

3、在传统的农杆菌共培养的技术基础上，农杆菌负压转化技术已经应用到包括茶树在内的多种植物材料上并取得了良好的结果。在系统负压平衡形成过程中，细胞间隙间的空气被抽出，细胞组织结构因压力变化而发生弹性变形。复压时随着弹性变形回复，农杆菌菌液和空气重新进入组织内，除表面细胞外，农杆菌也与组织内部细胞充分接触，从而提高了转化效率。但在复压过程中，外部的带有大量微生物的空气会进入无菌的转化装置，导致材料发生微生物污染。

4、因此，去除空气中的微生物是减少污染、提升侵染效率和转化稳定性的关键措施之一，具有重要的应用价值。

5、引用文献如下：

6、1、agrobacterium transformation of tea plants (camellia sinensis (l.)kuntze): a small experiment with great prospects. -

plants, 2024,

13(5), 675；

7、2、茶树离体再生和遗传转化的研究进展. 安徽农业大学学报，2021，48（5），738；

8、3、effects of catechins on agrobacterium-mediated genetictransformation of camellia sinensis, plant cell，tissue and organ culture，2014，119，27 ；

9、4、agrobacterium rhizogenes: paving the road to research and breedingfor woody plants, front in plant science, 2023, 14, 1196561. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1196561。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种茶树进行农杆菌渗透转化过程中防止、降低真菌污染的方法和所用装置。

2、为了解决上述问题，本发明提供一种提高茶树农杆菌渗透转化效率的装置，包括真空侵染装置，还包括空气无菌处理综合装置；

3、所述空气无菌处理综合装置包括相连的空气灭菌装置和空气净化装置；

4、空气灭菌装置、空气净化装置的结构类同，均为：包括一个密闭的容器，容器中装有液体，在容器的顶部分别设有进气管和排气管；进气管深入至容器内所装的液体中，进气管的底端设置气石（气石用于分散空气气流，且气石靠近容器的底部）；气体从进气管通入后，在气石作用下分散成细小的气泡后进入液体中（以增加表面积，提高处理效果）；通过液体处理后的空气从液体中逸出再回到位于液体上方的容器上部空间；排气管的底端位于液体上方的容器上部空间中（且靠近容器的顶部）；

5、空气灭菌装置的排气管与空气净化装置的进气管密封连接，空气净化装置的排气管与真空侵染装置的进气端阀门密封连接，真空侵染装置的抽气端阀门与真空泵相连，从而将空气灭菌装置、空气净化装置和真空侵染装置组一个密封的系统。

6、作为本发明的提高茶树农杆菌渗透转化效率的装置的改进：

7、空气灭菌装置中的液体为溶于水的杀菌剂；

8、空气净化装置中的液体为无菌水。

9、说明：无菌水的作用是将灭菌处理后空气中可能带有的杀菌剂洗涤干净，保证进入农杆菌侵染系统中的空气不会影响植物材料和农杆菌的生长。

10、作为本发明的提高茶树农杆菌渗透转化效率的装置的进一步改进：

11、所述杀菌剂为以下任一：次氯酸钠、升汞、强酸、强碱。

12、即，溶于水的杀菌剂例如为高浓度的次氯酸钠（20%次氯酸钠）、升汞等，或者是强酸、强碱的水溶液。

13、本发明还同时提供了一种利用上述装置进行的提高茶树农杆菌渗透转化效率的方法，包括以下步骤：

14、1）、将同时装有植物材料和农杆菌的容器放置于真空侵染装置内；

15、2）、首先打开真空泵抽真空，系统（包括空气灭菌装置、空气净化装置和真空侵染装置）内的原气体（原空气）由真空泵排出，直至整个密闭系统中的气体为灭菌、净化后的空气后，关闭真空侵染装置的进气端阀门，抽真空至设定的气压，关闭真空泵和抽气端阀门，使真空侵染装置维持所需的负压状态（例如抽真空至真空侵染装置内的压力为0.08mpa左右）；到达设定侵染时间（例如为8~12分钟）后，打开（缓慢打开）真空侵染装置进气端阀门，通过空气灭菌装置和空气净化装置充分灭菌和净化后的洁净空气进入真空侵染装置进行复压（恢复至常压），农杆菌溶液也随着复压的过程进入到处理材料（植物材料）的内部；使内外压强恢复平衡。

16、农杆菌负压渗透转化法是农杆菌常压转化法的重要改进之一，是解决农杆菌常压转化法效率低下的重要措施。但在系统的复压（恢复至常压）过程中，未经处理的外界空气进入系统后，其携带的微生物常常导致处理材料的污染。本发明在常规的农杆菌侵染装置前增加了空气无菌处理综合装置，空气先后经过灭菌和净化，成为无菌空气，可以大大提供农杆菌转化的效率、可重复率和成功率。

17、即，采用本发明能实现：在复压过程中，进入系统的空气预先经过灭菌和净化处理，保证在整个处理过程中均为无菌状态，防止微生物污染，从而显著提高遗传转化的效率、稳定性和可重复性。

18、综上，本发明涉及一种利用农杆菌作为介导，对重要的经济作物茶树（

camellia

sinensis）的外植体进行高效、稳定遗传转化的体系及方法。本发明为茶树的功能基因组学研究、种质资源创新和分子育种提供了重要的技术平台。