水稻PPO2酶突变体及其抗PPO类除草剂植物培育中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及水稻ppo2酶突变体及其抗ppo类除草剂植物培育中的应用。

背景技术：

1、农业生产中，杂草与栽培作物在光照、水分、养分及生长空间等方面存在显著竞争关系，这种竞争态势对作物的产量形成和品质提升构成严重制约。当前化学除草仍是农业杂草防控体系的核心手段，然而长期单一施用特定除草剂不仅会诱发杂草种群产生抗药性，还可能对作物本身造成药害风险。培育抗除草剂作物品种被认为是应对杂草抗药性演化和减轻作物药害效应的有效策略，其中原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen ixoxidase，ppox/ppx/ppo；ec 1.3.3.4）作为关键靶标酶，在抗除草剂作物研发中具有重要理论价值和应用前景。

2、ppo酶广泛分布于动物、植物、真菌及细菌等生物体中，其功能是在分子氧存在条件下催化原卟啉原ix氧化生成具有光敏特性的原卟啉ix，该酶是叶绿素与亚铁血红素生物合成途径的终端关键酶。高等植物通常至少编码两种ppo基因亚型（ppo1和ppo2），其中ppo1主要定位于叶绿体基质，而ppo2则主要分布于线粒体。在植物生理过程中，ppo酶是除草剂的重要分子靶点。ppo抑制剂类除草剂通过特异性抑制该酶活性，导致原卟啉原ix在叶绿体内异常积累并外渗至胞质，经快速氧化形成原卟啉ix。后者在光照条件下通过光动力学作用产生活性氧自由基，诱发细胞膜脂质过氧化链式反应，最终引起植物细胞程序性死亡。基于此独特作用机制，该类除草剂被归类为光依赖性除草剂。

3、ppo抑制剂类除草剂具有显著的触杀特性，其在土壤环境中的残留期较短，对轮作作物安全性较高，且具备广谱除草活性，可有效防除多种单子叶和双子叶杂草。自20世纪60年代起，ppo抑制剂已成功应用于农田杂草的选择性防控。目前商业化应用的ppo抑制剂包括苯嘧磺草胺、二苯醚类、三唑啉酮类、三嗪酮类、噻二唑类及恶唑烷酮类等结构类型。值得注意的是，随着这类除草剂的长期使用，全球已出现多例ppo靶标抗性杂草种群。例如：在amaranthustuberculatus中的ppo2l基因的210位甘氨酸发生缺失(δ g210)产生了对除草剂-乳氟禾草灵(lactofen)的抗性；在amaranthuspalmeri中的ppo2基因的98位精氨基酸突变为甘氨酸或甲硫氨酸 (r98g,r98m)产生了对除草剂氟磺胺草醚(fomesafen)的抗性。

4、鉴于公众对转基因作物外源基因安全性的关注，化学诱变与基因编辑技术产物正获得日益广泛的接受度。特别是crispr等基因编辑技术凭借其高效性和位点特异性优势，已成为抗草甘膦作物研发的新兴方向。通过精准引入少量关键位点突变，即可获得兼具理想农艺性状与高商业价值的目标作物品种。已有在oryzasativajaponica的ppo2基因的422位亮氨酸突变为甲硫氨酸（l422m）、442位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸（f422m）产生了对除草剂氟草啶的抗性的案例。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供水稻ppo2酶突变体及其抗ppo类除草剂植物培育中的应用，从而使得突变后的植物具有ppo类除草剂抗性。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种水稻ppo2酶突变体，其由来源于水稻的野生型ppo2酶的第404位氨基酸发生突变得到，水稻的野生型ppo2酶的氨基酸序列如seqidno：1所示，第404位氨基酸突变后的氨基酸选自c、f、i、l、m、w、v或y。

4、第二方面，本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述任一项的水稻ppo2酶突变体。

5、第三方面，本发明还提供了一种表达盒，其包括上述的核酸分子。

6、第四方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子或上述的表达盒。

7、第五方面，本发明还提供了一种重组菌或重组细胞，其包括：上述的核酸分子、上述的表达盒或上述的载体，且重组细胞不属于植物细胞。

8、第六方面，本发明还提供了水稻ppo2酶突变体、核酸分子、表达盒、载体或上述的重组菌或重组细胞在培育抗ppo类除草剂植物中的应用。

9、第七方面，本发明还提供了一种培育抗ppo类除草剂植物的方法，其包括如下任意一项的方法：

10、（1）将上述核酸分子或表达盒送入目的植物细胞；

11、（2）将上述的载体转化目的植物；

12、（3）将上述的重组菌或重组细胞导入目的植物；

13、（4）对目的植物细胞进行内源ppo2基因编辑，使其编码上述的水稻ppo2酶突变体。

14、（5）对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变、筛选，使其编码所述水稻ppo2突变体。

15、本发明具有以下有益效果：

16、本发明提供了一种耐ppo类除草剂的水稻ppo2酶突变体，与野生型水稻ppo2酶相比，在第404位氨基酸进行了突变，突变后的氨基酸选自c、f、i、l、m、w、v或y。本发明提供的ppo2酶突变体来源于水稻，更容易被消费者接受。通过对野生型水稻ppo2基因进行特定位点的修饰后，可得到耐ppo类除草剂的水稻。

17、转化该ppo2酶突变体的植物不仅具有适于商业化应用的ppo类除草剂抗性，也能够保持ppo2酶正常的酶催化活性，可以满足植物正常的生长和发育需求。

1.一种水稻ppo2酶突变体，其特征在于，其由来源于水稻的野生型ppo2酶的第404位氨基酸发生突变得到，水稻的野生型ppo2酶的氨基酸序列如seqidno：1所示，第404位氨基酸突变后的氨基酸选自c、f、i、l、m、w、v或y。

2.根据权利要求1所述的水稻ppo2酶突变体，其特征在于，第404位氨基酸突变后的氨基酸选自：c、i、l、m、v或w。

3.根据权利要求1或2所述的水稻ppo2酶突变体，其特征在于，第404位氨基酸突变后的氨基酸选自：c、i、l、m或v。

4.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的水稻ppo2酶突变体。

5.一种表达盒，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子；

6.一种载体，其特征在于，其包括权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达盒；

7.一种重组菌或重组细胞，其特征在于，其包括：权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的载体，且所述重组细胞不属于植物细胞；

8.如权利要求1-3任一项所述的水稻ppo2酶突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达盒、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的重组菌或重组细胞在培育抗ppo类除草剂植物中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述ppo抑制剂类除草剂选自二苯醚类除草剂、三唑啉酮类除草剂、三嗪酮类除草剂、噻二唑类除草剂、恶唑烷酮类除草剂、脲嘧啶类除草剂、嘧啶二酮类除草剂和n-苯酰亚胺类除草剂中的至少一种；

10.一种培育抗ppo类除草剂植物的方法，其特征在于，其包括如下任意一项的方法：