一种适用于中高温催化体系的CALA突变体及其应用

本发明属于基因工程，涉及一种适用于中高温催化体系的cala突变体及其应用。

背景技术：

1、脂肪酶（ec 3.1.1.3）是一类广泛存在于微生物及动植物组织中的水解酶，可催化油脂的水解，并在非水相介质中催化酯化、转酯化等反应，已广泛应用于油脂加工、洗涤剂、生物柴油制备及手性合成等多个领域。来自南极假丝酵母（

candida antarctica）的脂肪酶a（cala）属于α/β水解酶家族，由催化三联体ser184、asp334和his366构成活性中心，该酶在中高温条件下具有显著的催化活性，但其热稳定性不足，在较高温度下长时间连续催化易发生构象失稳和活性衰减，难以满足工业规模连续操作对酶制剂操作稳定性的要求，从而限制了cala在中高温工艺中的应用。

2、现有技术已尝试通过定点突变或定向进化对cala进行热稳定性改造，但所得突变体往往在热稳定性提高的同时出现催化活性下降，难以同时兼顾热稳定性与催化活性。此外，也有研究采用固定化、化学修饰等非基因工程手段改善cala的稳定性，例如将cala固定于介孔有机硅材料或immobead 150等载体上，可在一定程度上提高其热稳定性和重复利用率，但固定化酶在长期操作中仍存在活性衰减问题。因此，亟需提供一种在中高温条件下同时具有较高催化活性和良好热稳定性的cala突变体，以满足中高温工业催化对酶稳定性和活性的需求。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种适用于中高温催化体系的cala突变体及其应用。本发明将野生型cala的第433位赖氨酸突变为甘氨酸得到该cala突变体，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。本发明cala突变体具有相比于野生型更高的中高温催化活性和更优异的高温稳定性，该突变体在55℃~85℃温度范围内酶活均优于野生型，在30℃~80℃范围内残余酶活均高于野生型，尤其在50℃以上高温区间的稳定性优势更为明显。70℃处理时，野生型残余酶活降至47.73%±3.95%，而突变体v4仍高达141.13%±4.08%，约为野生型的2.96倍；80℃处理时，野生型为42.5%±5.28%，突变体v4为84.1%±2.79%，约为野生型的1.98倍。本发明提供一种适用于中高温催化体系的cala突变体，在油脂加工、洗涤剂工业及高温酶催化反应等领域具有良好的应用潜力。

2、一方面，本发明提供一种适用于中高温催化体系的cala突变体，所述中高温的温度范围为55℃~85℃；

3、所述cala突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、具体地，本发明通过试验发现，突变体v4在中高温下的催化活性优于野生型，其热稳定性显著优于野生型。野生型cala的最适反应温度为70℃，该温度下酶活力最高，约969.31±9.75 u/ml。本发明cala突变体（v4）的最适温度同样为70℃，该温度下酶活力约为1014.59±9.70 u/ml，高于野生型cala。且突变体v4在30℃~80℃范围内残余酶活均高于野生型，尤其在50℃以上高温区间优势更为明显，在70℃处理时，野生型残余酶活降至47.73%±3.95%，而v4仍高达141.13%±4.08%，约为野生型的2.96倍；在80℃处理时，野生型为42.5%±5.28%，突变体v4为84.1%±2.79%，约为野生型的1.98倍。表明本发明提供的适用于中高温催化体系的cala突变体具有相比于野生型更高的中高温催化活性和更优异的高温稳定性。

5、另一方面，本发明请求保护编码上述cala突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

6、另一方面，本发明请求保护一种重组质粒，携带上述编码cala突变体的基因。

7、另一方面，本发明请求保护一种宿主细胞，携带上述编码cala突变体的基因或上述重组质粒。

8、另一方面，本发明请求保护上述cala突变体的制备方法，将野生型cala的第433位赖氨酸突变为甘氨酸得到所述cala突变体。

9、所述野生型cala的氨基酸序列如seq id no:1所示。

10、还有，本发明请求保护上述cala突变体或编码cala突变体的基因或重组质粒或宿主细胞在油脂加工、洗涤剂制备、中高温催化酶制备中的应用。

11、进一步地，所述中高温催化酶的工作温度为55℃~85℃。

12、与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：

13、本发明将野生型cala的第433位赖氨酸突变为甘氨酸得到该cala突变体，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:3所示。本发明突变体v4在中高温下的催化活性优于野生型，其热稳定性显著优于野生型。野生型cala的最适反应温度为70℃，该温度下酶活力最高，约969.31±9.75 u/ml。本发明cala突变体（v4）的最适温度同样为70℃，该温度下酶活力约为1014.59±9.70 u/ml，高于野生型cala。且突变体v4在30℃~80℃范围内残余酶活均高于野生型，尤其在50℃以上高温区间优势更为明显，在70℃处理时，野生型残余酶活降至47.73%±3.95%，而突变体v4仍高达141.13%±4.08%，约为野生型的2.96倍；在80℃处理时，野生型为42.5%±5.28%，突变体v4为84.1%±2.79%，约为野生型的1.98倍。表明本发明提供的适用于中高温催化体系的cala突变体具有相比于野生型更高的中高温催化活性和更优异的高温稳定性。该cala突变体还具有对中长链脂肪酸c12和c14更优的底物选择性。上述特性使cala突变体在油脂加工、洗涤剂工业及高温催化反应等领域具有良好的应用前景，本发明通过单点定点突变实现了多维度酶学性质的协同提升，为高温工业催化提供了一种性能优异的候选酶制剂。

1.一种适用于中高温催化体系的cala突变体，其特征在于，所述中高温的温度范围为55℃~85℃；

2.编码权利要求1所述cala突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seqid no:3所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，携带权利要求2所述的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，携带权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒。

5.权利要求1所述的cala突变体的制备方法，其特征在于，将野生型cala的第433位赖氨酸突变为甘氨酸得到所述cala突变体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述野生型cala的氨基酸序列如seqid no:1所示。

7.权利要求1所述的cala突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒或权利要求4所述的宿主细胞在油脂加工、洗涤剂制备、中高温催化酶制备中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述中高温催化酶的工作温度为55℃~85℃。