一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的双重PCR分子检测引物组合、试剂盒和检测方法

本发明涉及植物病害检测，特别是涉及一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的双重pcr分子检测引物组合、试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、玉米大斑病（corn northern leaf blight）与小斑病（corn southern leafblight）是玉米生产中普遍发生的两种真菌病害，前者由大斑病凸脐蠕孢exserohilumturcicum  (pass.）leonay et suggs侵染引起，其主要危害玉米叶片，典型症状上病斑长梭形，呈灰褐色或黄褐色，长5-10 cm，宽1 cm左右，有的病斑更大，或几个病斑相连成大的不规则形枯斑，严重时叶片枯。玉米小斑病则由长蠕孢菌bipolaris maydis (nishik.)shoemaker.引起，该病害在玉米整个生育期内都可发生，但以抽雄、灌浆期发病严重，主要为害叶片，但叶鞘、苞叶和果穗也能受害，在叶片上病斑较小，病斑数量多，在高温多湿条件下，病斑表面密生一层灰色的霉状物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。玉米大斑病和小斑病二者最初侵染源均为病残体内越冬的分生孢子或菌丝体。玉米生长季节，越冬菌源产生孢子，随雨水飞溅或气流传播到玉米叶片上，遇适宜温度、湿度条件萌发入侵，经10-14 d，便可产生大量的分生孢子，分生孢子随风雨传播，重复侵染。玉米大斑病和小斑病在我国玉米主要种植区通常相伴发生，一旦发病就会造成巨大的经济损失，严重地块发病率高达45%以上，产量损失率15%~27%，最严重时达50%以上。玉米大斑病和小斑病都是典型的风、雨传播病害，这两种病害一旦发生，生产上防控极为困难，病害的早期诊断对防止病害传播蔓延和病害防控尤为重要，因此，建立病害特异性强、灵敏性高且高通量的检测技术体系对病害及时高效防控十分重要。

2、玉米叶部病害传统检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等手段，这些方法的检测时间长，需要一定的专业鉴定知识支撑，这些缺欠限制了病害传统检测鉴定方法的广泛应用。随着分子生物学技术的不断发展，基于核酸的快速检测技术发挥了越来越重要的作用，这些技术主要包括pcr（polymerase chain reaction）、lamp（loop-mediated isothermal amplification）和rpa（recombinant enzyme polymeraseamplification）等，但这些方法往往只限于检测1种病原菌，对症状类似的病害难以区分或准确诊断，难以满足田间基层的快速、准确诊断的迫切需求。然而，在实际生产中，往往是两种或多种病原菌同时在作物同一生育期存在，此时，通过单一病原菌的检测技术一一检测势必造成诸多麻烦，如费工费时，且检测成本高等。

3、多重pcr是一种pcr衍生方法，是一种在同一个反应体系对多个dna模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的pcr技术，能够一次实现对多种病原菌的检测，其特点是耗时短的同时提高准确性和灵敏度。多重pcr技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，在植物病原菌的鉴定和检测，尤其是对症状类似或病原菌复合侵染的检测中具有广泛的应用前景并已广泛地应用于多种病原微生物同时检测。玉米大斑病菌和小斑病菌可同时混合侵染玉米叶片产生叶斑病，在发病初期，该两种病原菌所引起的症状非常相似，肉眼很难区分，导致传统的早期诊断方法无法快速地得到准确结果，阻碍了正确防控措施的制定，大大降低了病害的防治效果。目前尚未见玉米大斑病菌和小斑病菌双重pcr检测的报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的双重pcr分子检测引物组合、试剂盒和检测方法，本放以玉米大斑病菌和小斑病菌翻译延伸因子基因（translation elongation factor 1 alpha gene，tef-1α）保守位点为靶标，设计特异性引物、优化反应温度、建立双重pcr检测方法，以期达到高通量、快速、灵敏、准确区分玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的检测诊断，为玉米叶斑病高效防控提供技术支撑。本发明通过比对玉米大斑病菌exserohilum turcicum和玉米小斑病菌bipolaris maydis翻译延伸因子基因（tef-1α）序列保守位点，设计e. turcicum和b. maydis pcr反应特异性引物e-f/e-r和b-f/b-r，在pcr反应温度优化的基础上，建立可同时e. turcicum和b. maydis的双重 pcr 检测方法，对所建立的双重pcr的特异性、灵敏度和应用性进行了测试和评估，最终建立了适用于快速检测e. turcicum和b. maydis的双重pcr检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的双重pcr分子检测引物组合，包括检测玉米大斑病菌引物对和检测玉米小斑病菌引物对；

4、所述检测玉米大斑病菌引物对的上游引物e-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物e-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、所述检测玉米小斑病菌引物对的上游引物b-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物b-f的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、本发明还提供了一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的试剂盒，包括上述技术方案所述的双重pcr分子检测引物组合。

7、本发明还提供了上述技术方案所述的双重pcr分子检测引物组合或上述技术方案所述的试剂盒在同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌中的应用。

8、本发明还提供了一种同时检测玉米大斑病菌和玉米小斑病菌的方法，包括以下步骤：

9、1）提取待检样品的基因组dna；

10、2）以步骤1）所述基因组dna为模板，经上述技术方案所述的双重pcr分子检测引物组合进行pcr扩增，得到扩增产物；

11、3）将步骤2）所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，当扩增出309bp条带时，检测出玉米大斑病菌；

12、当扩增出201bp条带时，检测出玉米小斑病菌。

13、优选的，步骤1）所述待检样品包括玉米叶片。

14、优选的，步骤2）所述pcr扩增的体系为：2×taq pcr mastermix 12.5 μl，基因组dna 1.0 μl，10.0 μm上游引物e-f 1.0 μl，10.0 μm下游引物e-r 1.0 μl，10.0 μm上游引物b-f 1.0 μl，10.0 μm下游引物b-r 1.0 μl，ddh2o补足至25 μl。

15、优选的，步骤2）所述pcr扩增的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55.5℃退火30 s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10 min，12℃ 保存。

16、优选的，步骤3）所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分含量为2%。

17、本发明的有益效果：

18、1.引物设计科学、合理：本发明双重pcr分子检测体系以两对引物对两种目标病原菌基因组dna同时进行反应，对引物的质量要求较高，不同引物之间不能形成稳定的二级结构，在满足引物特异性和灵敏性的同时，还要符合双重pcr的条件；

19、2.特异性强、灵敏度高：本发明检测方法是根据种间变异、种内保守的翻译延伸因子基因（translation elongation factor 1 alpha gene，tef-1α）序列保守位点设计了一对特异引物组合建立了玉米大斑病菌e. turcicu和玉米小斑病菌b. maydis的双重pcr检测方法，能将玉米大斑病菌e. turcicu和玉米小斑病菌b. maydis区别开来，只对玉米大斑病菌e. turcicu和玉米小斑病菌b. maydis有扩增作用，对其它不同近缘种病菌均无扩增作用，具有很强的特异性。本发明的双重pcr引物可以在菌量较少的情况下检测到病原菌的存在，实验证明，当待测样品浓度达100 fg/μl时即可检出，表明上述方法具有较高的灵敏性。

20、3.实用性好：本发明建立的双重pcr检测体系实现了对玉米大斑病菌e. turcicu和玉米小斑病菌b. maydis的同时检测，与传统症状识别、病原菌形态鉴定及普通单引物pcr或lamp相比，本发明建立的双重pcr检测体系具经济简便，节约成本、耗时短等优点，可用于玉米叶斑病发病早期的快速鉴定，有利于提前对玉米叶斑病进行有效防治；

21、4.操作快速简便：对两种病原菌进行检测通常需要进行两个pcr反应，应用本发明方法，可在同一个反应体系中一次实现对玉米大斑病菌e. turcicu和玉米小斑病菌b.maydis的同时检测的检测，无需多次反应，缩短了检测时间，减少了操作步骤，整个检测过程可在数小时内完成；

22、5.检测成本低，省力：利用本发明不需要昂贵的荧光pcr仪，也不需要合成昂贵的探针及相应的试剂，一次pcr反应便可同时完成两个目标病原菌检测，减半了试剂、时间和人力的投入，降低了检测成本，利于推广应用。