面粉中偶氮甲酰胺的快速检测方法及其检测装置与流程

本发明涉及食品安全的免疫学检测，更具体地，本发明涉及面粉中偶氮甲酰胺的快速检测方法及其检测装置。

背景技术：

1、偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ada）是面粉改良添加剂，长期应用于国内面粉加工行业。随着食品安全毒理研究不断深入，ada的安全风险逐渐凸显。该物质化学稳定性差，在面粉蒸煮、烘焙加工过程中易降解生成氨基脲等有毒衍生物，该产物具有潜在蓄积毒性与致突变风险，长期摄入将危害人体肝肾等脏器健康。

2、现阶段面粉中ada的标准检测方法为高效液相色谱法、液质联用法等仪器检测技术。此类方法检测准确度高，但存在明显短板：样品前处理繁琐，需衍生、净化等多步操作，检测周期长；高度依赖大型精密仪器与专业操作人员，检测成本高、场地要求严苛，无法适配生产线快速筛查、市场现场抽检、基层批量检测等场景，难以满足常态化食品安全快速监管需求。 免疫检测技术凭借特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、成本低廉、无需大型仪器等优势，已成为食品小分子添加剂快速筛查的核心技术。但目前针对偶氮甲酰胺的免疫检测技术仍存在明显空白，ada为小分子半抗原，无天然免疫原性，且面粉基质干扰复杂，高特异性人工抗原构建、优质抗体制备、稳定检测体系优化等关键技术尚未成熟，缺乏适配面粉样品的快速免疫检测方案。因此，需要开发一种高灵敏、高特异性、稳定性优异的面粉中偶氮甲酰胺的免疫技术检测方法，实现对面粉中偶氮甲酰胺残留的高效、现场、批量筛查。

技术实现思路

1、为了解决现有检测方法所存在的问题，本发明。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种偶氮甲酰胺衍生物，其结构如式（ⅰ）所示：

3、，式（ⅰ）。

4、根据本发明的另一个方面，提供了一种制备权利要求1所述的偶氮甲酰胺衍生物的方法，该方法为向对甲苯亚磺酸盐水溶液中，加入偶氮甲酰胺进行反应，待无气体放出时，停止反应，降温，过滤水洗，干燥，制备得到结构如式（ⅰ）所示的偶氮甲酰胺衍生物，即对甲苯磺酰氨基脲，该方法的反应式如式（ⅱ）所示：

5、，式（ⅱ）。

6、根据本发明的再一个方面，提供了一种偶氮甲酰胺衍生物的半抗原，其结构如式（ⅲ）所示：

7、，式（ⅲ）。

8、根据本发明的第四个方面，提供了一种制备偶氮甲酰胺衍生物的半抗原的方法，包括以下步骤：

9、s1.称取亚硫酸钠，用水溶解后升温，缓慢滴加乙烯基苯磺酰氯，同时滴加饱和碳酸氢钠溶液，控制ph 7-8，保温反应，得到含中间体1的水溶液，本步骤的反应式如式（ⅳ）所示：

10、，式（ⅳ）；

11、s2.向步骤s1制备的含中间体1的水溶液中，加入偶氮甲酰胺，搅拌反应，待无气体放出时，停止反应，降温，过滤水洗，干燥，得到中间体2，本步骤的反应式如式（ⅴ）所示：

12、，式（ⅴ）；

13、s3.将中间体2溶于无水乙腈，加入aibn、3-巯基丙酸，氮气保护下回流过夜反应，反应结束后，蒸干溶剂，直接过柱纯化，得到结构如式（ⅱ）所示的偶氮甲酰胺衍生物的半抗原，本步骤的反应式如式（ⅵ）所示：

14、，式（ⅵ）。

15、根据本发明的第五个方面，提供了偶氮甲酰胺衍生物的抗原，该偶氮甲酰胺衍生物的抗原为偶氮甲酰胺衍生物的半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

16、根据本发明的第六个方面，提供了偶氮甲酰胺衍生物的半抗原或偶氮甲酰胺衍生物的抗原在偶氮甲酰胺及偶氮甲酰胺衍生物的免疫学检测中非疾病诊断的应用。

17、根据本发明的第七个方面，提供了偶氮甲酰胺衍生物在偶氮甲酰胺及偶氮甲酰胺衍生物的免疫学检测中作为标准物质的应用。

18、根据本发明的第八个方面，提供了偶氮甲酰胺衍生物抗体，偶氮甲酰胺衍生物抗体是由偶氮甲酰胺衍生物的抗原经动物免疫制备得到，偶氮甲酰胺衍生物抗体为单克隆抗体。

19、根据本发明的第九个方面，提供了一种偶氮甲酰胺的检测装置，包括试纸条和微孔试剂，试纸条设有检测线，检测线包被有偶氮甲酰胺衍生物的抗原，微孔试剂中含有胶体金标记的的偶氮甲酰胺衍生物抗体。

20、根据本发明的第十个方面，提供了一种面粉中偶氮甲酰胺的快速检测方法，该方法为采用上述制备偶氮甲酰胺衍生物的方法，对待测样品中的偶氮甲酰胺进行衍生化处理，然后使用上述一种偶氮甲酰胺的检测装置对待测样品中的偶氮甲酰胺衍生物进行检测，待测样品为面粉。

21、本发明的有益效果：本发明提供了偶氮甲酰胺衍生物、偶氮甲酰胺衍生物的半抗原，制备时使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、合成步骤简洁有效、反应产率较高，还提供了由偶氮甲酰胺衍生物的半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及特异性针对偶氮甲酰胺衍生物的抗体，该抗体对偶氮甲酰胺衍生物的ic50值为0.97 ng/ml，线性范围为0.36ng/ml-2.61 ng/ml，符合快速检测偶氮甲酰胺的标准。本发明应用免疫学检测方法，对面粉中的偶氮甲酰胺进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足食品生产企业自查，检测机构现场快速检测的需要。

1.偶氮甲酰胺衍生物，其特征在于，其结构如式（ⅰ）所示：

2.制备权利要求1所述的偶氮甲酰胺衍生物的方法，其特征在于，所述方法为向对甲苯亚磺酸盐水溶液中，加入偶氮甲酰胺进行反应，待无气体放出时，停止反应，降温，过滤水洗，干燥，制备得到结构如式（ⅰ）所示的偶氮甲酰胺衍生物，即对甲苯磺酰氨基脲，该方法的反应式如式（ⅱ）所示：

3.偶氮甲酰胺衍生物的半抗原，其特征在于，其结构如式（ⅲ）所示：

4.制备权利要求3所述的偶氮甲酰胺衍生物的半抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.偶氮甲酰胺衍生物的抗原，其特征在于，所述偶氮甲酰胺衍生物的抗原为权利要求3所述的偶氮甲酰胺衍生物的半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。

6.权利要求3所述的偶氮甲酰胺衍生物的半抗原或权利要求5所述的偶氮甲酰胺衍生物的抗原在偶氮甲酰胺及偶氮甲酰胺衍生物的免疫学检测中非疾病诊断的应用。

7.权利要求1所述的偶氮甲酰胺衍生物在偶氮甲酰胺及偶氮甲酰胺衍生物的免疫学检测中作为标准物质的应用。

8.偶氮甲酰胺衍生物抗体，其特征在于，所述偶氮甲酰胺衍生物抗体是由权利要求5所述的偶氮甲酰胺衍生物的抗原经动物免疫制备得到，所述偶氮甲酰胺衍生物抗体为单克隆抗体。

9.一种偶氮甲酰胺的检测装置，其特征在于，包括试纸条和微孔试剂，所述试纸条设有检测线，所述检测线包被有权利要求5所述的偶氮甲酰胺衍生物的抗原，所述微孔试剂中含有胶体金标记的权利要求8所述的偶氮甲酰胺衍生物抗体。

10.一种面粉中偶氮甲酰胺的快速检测方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求2所述的制备偶氮甲酰胺衍生物的方法，对待测样品中的偶氮甲酰胺进行衍生化处理，然后使用权利要求8所述的一种偶氮甲酰胺的检测装置对待测样品中的偶氮甲酰胺衍生物进行检测，所述待测样品为面粉。