一种检测核桃源性成分的荧光RPA核酸组合、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及食品检测领域，更具体地，涉及一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、核桃属于常见致敏坚果，常添加于植物蛋白饮料中，食品安全监管需快速、精准检出饮品内微量核桃源性核酸，防范致敏成分标注不合规问题。

2、荧光pcr方法如专利cn110846410a公开了食品核桃过敏原荧光定量pcr检测方案，该方案扩增需完整升降温循环，整套检测时长超90 min，无法适配农贸市场、生产车间现场即时筛查；核桃乳基质中大量油脂、多糖、蛋白会强烈抑制taq聚合酶活性，核酸前处理步骤繁杂；该方案核酸检出下限仅10-1 ng/µl，针对仅含微量核桃掺假的饮品样品易出现假阴性，痕量组分分辨能力不足。

3、恒温rpa技术无需变温仪器，但现有坚果检测rpa体系存在明显不足：引物扩增启动滞后、低拷贝核酸荧光信号弱；体系组分配比不适配高脂核桃乳，难以稳定检出质量占比0.1%的微量核桃掺假样品；核酸组合易与碧根果、榛子等近缘坚果发生交叉扩增，特异性较差。

4、综上，现有核桃源成分检测方案存在前处理操作复杂、微量样品检出能力不足、物种特异性弱等缺陷，无法满足高脂植物蛋白饮料快速监管筛查的实际需求。

技术实现思路

1、本发明为克服上述现有技术所述的高脂植物蛋白饮料核桃成分检测中前处理操作复杂、微量样品检出能力不足、物种特异性弱等缺陷，提供一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合；

2、本申请的另一目的在于提供一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合的应用；

3、本申请的另一目的在于提供一种检测核桃源性成分的荧光rpa试剂盒；

4、本申请的另一目的在于提供一种核桃源性成分的荧光rpa检测方法；

5、本申请的另一目的在于提供一种核桃源性成分的荧光rpa检测方法的应用。

6、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

7、一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合，包含上下游引物与荧光探针；上游引物的序列如seq id no .1所示、下游引物的序列如seq id no .2所示、荧光探针序列如seqid no .3所示；

8、seq id no.1：

9、5'- atgcgaacgacaatacaaggagcagcaaggc -3'；

10、seq id no .2：

11、5'- gtaattctcaatgccacgaaggagctcggtt -3'；

12、seq id no.3：

13、5’-acatgagtccgaggaaggtgaagttaaata/i6famdt// idsp//ibhq1dt/tgagaggttcacggaga(c3-spacer)-3’。

14、荧光探针以脱氧核苷酸链为主体骨架，序列中段依次引入i6fam荧光基团修饰、idsp间隔修饰与ibhq1淬灭基团；3’端添加c3-spacer封闭基团修饰。

15、一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合的应用，检测食品中的核桃源性成分。

16、一种检测核桃源性成分的荧光rpa试剂盒，包括权利要求1所述荧光rpa检测核桃源性成分的核酸组合。

17、进一步地，所述试剂盒还包括：反应缓冲液、复合酶制剂、醋酸镁溶液。

18、一种核桃源性成分的荧光rpa检测方法，采用所述核酸组合配制反应体系进行荧光rpa反应。

19、进一步地，所述反应体系中，上游引物的终浓度为400~600 nmol/l，下游引物的终浓度为400~600 nmol/l，荧光探针的终浓度为180~220 nmol/l，醋酸镁溶液的终浓度为17~19 mmol/l。

20、优选地，上游引物的终浓度为600 nmol/l，下游引物的终浓度为600 nmol/l，荧光探针的终浓度为200 nmol/l，醋酸镁溶液的终浓度为18 mmol/l。

21、优选地，所述体系中还包括反应缓冲液、复合酶制剂。

22、进一步地，rpa反应的温度为37~41℃，总反应时间15~25 min。

23、进一步地，rpa反应的温度为39℃，总反应时间20 min。

24、进一步地，包括以下步骤：

25、s1、提取待测样品的基因组dna；

26、s2、以提取的基因组dna为模板，配制相应反应体系，进行rpa扩增；

27、s3、若荧光强度随反应时间呈现持续上升的对数扩增曲线，则判定样品含有核桃源性成分；若无对数扩增上升趋势，判定样品不含核桃源性成分。

28、一种所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法的应用，用于检测植物蛋白食品中的核桃源性成分。

29、优选地，所述植物蛋白食品包括植物蛋白饮料。

30、进一步地，所述反应体系中，所用基因组dna由待测植物蛋白食品经异丙醇沉淀脱脂预处理后提取得到。

31、现有核桃荧光检测体系未针对植物蛋白饮料中高含量多糖、蛋白、油脂等抑制物设计核酸组合，体系中引物、探针与模板结合效率易受基质杂质干扰，扩增动力学受抑制，低比例核桃掺假样本易出现扩增信号微弱、假阴性问题。

32、本发明设计的引物与探针组合靶向核桃

jugr 2基因保守区段，退火结合效率高，在高多糖、高蛋白复杂基质dna模板存在杂质残留的条件下仍可稳定完成同源配对；同时配套建立异丙醇脱脂前处理体系，可有效去除油脂类强扩增抑制物，降低多糖、变性蛋白对rpa复合酶活性的干扰。本申请显著提升了高多糖、高蛋白复杂食品基质中核桃微量源性成分的检出稳定性，专门适配植物蛋白饮料类复杂基质样品的快速筛查检测。

33、与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：

34、本发明以核桃特异性过敏原基因

jugr2为靶标，建立了一种适用于植物蛋白饮料基质的实时荧光rpa快速检测方法。本发明方法在39℃恒温条件下扩增20分钟即可完成检测，特异性强，与常见谷物及坚果均无交叉反应；对核桃dna的检测灵敏度可达10-4 ng/μl，方法检出限为0.1%（质量分数）。对市售样品的检测结果与国家标准rt-pcr方法完全一致。与国标bjs 201707（rt-pcr）相比，本方法具有恒温、快速、前处理简便、设备要求低等优势，适用于市场监管现场的快速筛查及食品企业的自主质量控制。

1.一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合，其特征在于，包含上下游引物与荧光探针；上游引物的序列如seq id no .1所示、下游引物的序列如seq id no .2所示、荧光探针序列如seq id no .3所示；

2.一种检测核桃源性成分的荧光rpa核酸组合的应用，其特征在于，检测食品中的核桃源性成分。

3.一种检测核桃源性成分的荧光rpa试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述荧光rpa检测核桃源性成分的核酸组合。

4.根据权利要求3所述检测核桃源性成分的荧光rpa试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：反应缓冲液、复合酶制剂、醋酸镁溶液。

5.一种核桃源性成分的荧光rpa检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述核酸组合配制反应体系进行荧光rpa反应。

6.根据权利要求5所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法，其特征在于，所述反应体系中，上游引物的终浓度为400~600 nmol/l，下游引物的终浓度为400~600 nmol/l，荧光探针的终浓度为180~220 nmol/l，醋酸镁溶液的终浓度为17~19 mmol/l。

7.根据权利要求5所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法，其特征在于，rpa反应的温度为37~41℃，总反应时间15~25 min。

8.根据权利要求5所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.一种权利要求5所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法的应用，其特征在于，用于检测植物蛋白食品中的核桃源性成分。

10.根据权利要求9所述核桃源性成分的荧光rpa检测方法的应用，其特征在于，所述反应体系中，所用基因组dna由待测植物蛋白食品经异丙醇沉淀脱脂预处理后提取得到。