用于灵芝退化菌丝研究的内参基因及其引物和应用

本发明属于分子生物学，具体涉及适用于灵芝退化菌丝研究的内参基因及其引物和应用。

背景技术：

1、灵芝菌种经多次继代传代后极易出现菌种退化现象，典型表型包括菌丝生长速率显著下降、菌落边缘畸形、菌丝颜色异常等。从基因转录表达水平解析灵芝菌丝退化的分子调控机制，是揭示菌种退化内在机理的核心研究思路。实时荧光定量pcr（qpcr）凭借高灵敏度、强特异性与结果重复性佳等优势，现已成为定量检测基因表达丰度的主流技术。但qpcr定量结果的准确性高度依赖稳定内参基因的筛选与特异性扩增引物的合理设计。由此可见，筛选在退化灵芝菌丝中表达稳定的基因作为内参，并配套设计特异性扩增引物，是保障qpcr定量分析结果真实可靠的先决条件。

技术实现思路

1、针对现有技术中缺乏适用于灵芝退化菌丝研究的稳定内参基因，导致退化菌丝中基因表达量检测准确性不足的技术问题，本发明的目的在于提供一种灵芝内参基因及其特异性引物对，所述内参基因及引物对具有扩增效率高、稳定性好的特点，可用于灵芝退化菌丝基因表达量的检测。

2、为实现上述目的，本发明提供如下方案：

3、第一方面，本发明提供一种适用于灵芝退化菌丝研究的内参基因，所述的内参基因为硫氧还蛋白（thioredoxin, trx），核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：

4、atgctcgcctttgcgaggctctcattctctcttctcgtctcctccgtcatcctagcctccaccgccctccccgtccagtccgcagaaacagaactcttggtccttactccagagaacttcgactccaccatcgctcacggtgtctggttcatcgaacacttctctccctattgccaccactgcagagccttcgccccaacatggacacagctcgtcgaagccaacgacaagaaggccgatcccggcatccacctcgcccaggtcaactgtgctgtgcacggtgacctttgtcgtaagaacaacattgatggataccccatgatgaagctatacaaggatggacattacctcgagactttcgaacaggctaggagcatcgaacttctcaccaactacctcgccgcccatgcggaacccagcaacccccctgtccctgaaccaactagtaaatccggtaacgatgcggatcctcccgtgacgtcagacaaggacgagcttgcggaaaatgtcgtgttccacgaggatcggaatcctgagggcacagtccttcagttggatgagaagaacttccggcagaccattgacaaaggccatgtcttcgtcaagttcttcgccccgtggtgcggtcactgcaagaaacttgccccgagttggacccagctcgccagcttaatgcagcacaagctcaacattgccgaggtcaactgtgaagcacatagtgcgctttgcaagtcacagggcatcaccggataccctatgcttcactactacggtggcaagggcaccaagacggagtacactggcggccgcaaactggagcagctcttggctttcgcggagaaggtctctggccctggaatacaggaactcaaatatgatgagctgaagaccaccgtcgcggagcaccctgttctctacctcttccttcactctcccaacgataaagccatcttcactcaagttatcgaggcgtcgaacgtgctgttcggatctcccgcaatgtacacgtcgacgtccgcgtcgttctacgaccacttcaatatcaagcctggcaacgccgctatcctagccctcaaggacaatgatcccaccgctcccacctctatttacactctttctaagcccgcctctactgatgcggagcggcaggagctcgttaaatggctcctccacaaccgtctcccatccgccctcgagctcgactccgacaacttccaggatgtcatgaacgcgccgcacaagccgctcgtcgtcatcgccgcgacctcccagggcgacctccagcgtaccgcgaaggaggtcaccgacctcgcgcgcaagtggcgcgacgcgaaggagaaggctcccgtcgtcttcacgtggatggacgccgacaagtggggcacatggctcaagagcatgtacggcatcaccgcggaccacttgcctaggcccgttgttgccagccactctcggctcgtctattacgacgtcgatcctttcggcgacaaggttacgcttacgtccgccagcttgttcccgacgatcaacggtgctgcgatgggcacccttgcgtacaagcattctgagaacatcgtcgagcgtcttgccaggtatttgaacaacaagctgatgggcatcgagagctatgtcgtcgagaacccgtggcataccgtgttcttcggcatcgccgtcctggttggtatctaccttctcctcaggcggatcctggcagactcggatgatgcgagagaagggggatatttgcgcaagggcgaccgtctcgactag

5、优选地，所述内参基因作为内参用于灵芝退化菌丝中目的基因表达量的检测。

6、第二方面，本发明提供用于扩增上述内参基因的引物对，所述引物对的序列如下：

7、trx_f: tcgtctcctccgtcatccta（seq id no.2）；

8、trx_r: ccttcttgtcgttggcttcg（seq id no.3）。

9、第三方面，本发明提供上述的引物对在制备用于灵芝退化菌丝基因表达量检测的产品中的应用。

10、优选地，所述产品包括试剂盒。

11、第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含上述的引物对。

12、优选地，所述试剂盒还包括用于提取灵芝退化菌丝总rna的试剂、反转录试剂、荧光定量pcr试剂中的至少一种。

13、优选地，所述试剂盒还包括内参基因标准品，所述标准品为含有seq id no.1所示核苷酸序列的重组质粒。

14、优选地，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为无核酸酶水。

15、第五方面，本发明提供上述的内参基因、引物对或试剂盒在灵芝基因表达分析中的应用。

16、优选地，是在灵芝退化菌丝基因表达量检测中的应用。

17、第六方面，本发明提供一种灵芝退化菌丝基因表达量检测的方法，包括以下步骤：

18、s1：提取灵芝退化菌丝的总rna；

19、s2：将所述总rna反转录为cdna；

20、s3：以所述cdna为模板，利用上述的引物对进行荧光定量pcr，并以所述内参基因作为内参检测目的基因的相对表达量。

21、优选地，以上述内参基因作为内参，通过2－δδct法计算目的基因的相对表达量。

22、本发明具有以下有益效果：

23、与现有技术相比，本发明通过系统筛选获得了适用于灵芝退化菌丝研究的新型内参基因trx及其特异性引物对，该内参基因在不同灵芝菌株中表达稳定、标准差最小，显著优于cyp5和pp2a等候选内参基因；以该内参基因为参照进行qpcr检测时，其基因相对表达量计算结果与转录组数据的一致性显著高于现有内参基因，有效解决了灵芝退化菌丝因内参基因表达波动导致的目标基因表达量检测准确性不足的技术问题，为灵芝菌种退化机制研究及基因表达分析提供了稳定、可靠的分子工具。