一种端粒酶活性检测方法及检测试剂盒
本发明属于生物检测，具体涉及一种端粒酶活性检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
1、端粒（telomere）是真核生物线性染色体末端含dna重复序列（ttaggg）的dna-蛋白复合体，被视为守护基因组完整性的“末端护帽”，其长度在每个细胞周期的dna复制过程中会逐渐缩短。当端粒缩短至临界长度时，会引发程序性细胞死亡，细胞进入复制性衰老或凋亡。端粒酶（telomerase）是一种大型核糖核蛋白复合体，负责在线性染色体3′末端逐步合成端粒dna重复序列（ttaggg），从而逆转每轮复制过程中dna的丢失，是维持端粒长度的关键机制。1985年greider和blackburn在四膜虫细胞提取物中首次发现一种能以自身rna为模板合成端粒重复序列的逆转录活性酶，并命名为端粒酶，随后在其他纤毛虫中也被发现。后续研究发现，端粒酶活性在人hela细胞中被检测到并在多种人类癌症中被发现，从此，端粒酶的研究从纤毛虫领域拓展到了一般真核生物生物学领域。
2、端粒酶由两个核心组分构成：其一为由位于5号染色体5p15.33区域的人类htert基因编码并作为催化蛋白亚基的端粒酶逆转录酶（tert）；其二为由位于3号染色体3q26区域的hterc基因编码的人类端粒酶rna（htr）或人类端粒酶rna组分（hterc），是必需的rna组分。htr不仅作为模板参与端粒dna的合成，还参与端粒酶催化反应、定位及组装过程。
3、研究表明，端粒酶活性在正常体细胞中通常较低或检测不到，但在癌细胞中经常被重新激活，导致染色体末端端粒伸长，呈现出高表达水平。当端粒酶活性充足时，干细胞、生殖细胞及淋巴细胞可持续维持端粒长度，保证基因组稳定性和长期增殖潜能；而在端粒酶缺陷或活性不足的个体中，端粒进行性缩短会触发dna损伤反应，导致骨髓衰竭、肺纤维化、肝硬化等“端粒缩短综合征”表现。此外，端粒和端粒酶在多种疾病中起着关键作用，例如肝硬化和肝癌、前列腺癌以及子宫内膜病变。研究结果显示，约90%的恶性肿瘤通过tert启动子突变、超级增强子重编程或病毒癌蛋白（如hpv-e6）直接上调tert转录，使癌细胞端粒持续延长并逃避免疫清除，导致癌症发生与恶化，使得端粒酶成为可用于肿瘤诊断、预后评估和治疗的通用生物标志物及潜在靶点。基于端粒酶在肿瘤等重大疾病中的异常表达和组织特异性，使其成为癌症检测的重要生物标志物。因此，开发高灵敏度、高特异性的端粒酶检测技术对于癌症早期诊断、预后评估以及治疗监测具有重要的临床价值。
4、目前常见的端粒酶检测技术包括蛋白质印迹法（western blot, wb）、端粒重复序列扩增法（trap）、实时荧光trap法（qtrap）以及trap-酶联免疫吸附法（elisa）等。尽管这些技术在端粒酶活性分析、临床诊断等方面取得了较大进展，但仍具有不可避免的局限性，如操作繁琐、耗时长、需精密控温、蛋白酶参与导致成本高、易产生假阴性及假阳性结果以及存在非特异性干扰等。近年来，恒温无酶信号放大技术相继被引入端粒酶检测，可在恒定温度下将少量端粒酶延伸产物转化为大量可测信号，具有重大研究潜力。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种端粒酶活性检测方法及检测试剂盒。本发明通过封闭裂分型dnazyme与至少两条封闭链的封闭结构，并利用端粒酶延伸反应与链置换反应相偶联，在恒温无酶条件下实现了端粒酶活性的高灵敏度、低背景检测。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
3、本发明一方面提供一种端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：
4、提供功能性dna模块，所述功能性dna模块包含端粒酶引物和封闭裂分型dnazyme，所述端粒酶引物连接于所述封闭裂分型dnazyme，所述封闭裂分型dnazyme包含dnazyme核酸链和至少两条封闭链，所述dnazyme核酸链组装形成裂分的dnazyme催化核心，所述至少两条封闭链分别与所述dnazyme核酸链杂交，以抑制所述dnazyme核酸链的催化活性；
5、将待测样品与所述功能性dna模块混合，使待测样品中的端粒酶识别并延伸所述端粒酶引物，生成含有端粒重复序列的延伸产物；
6、所述延伸产物通过链置换反应将所述封闭链从所述封闭裂分型dnazyme上置换下来，使所述dnazyme核酸链恢复催化活性；
7、所述dnazyme核酸链切割底物链并产生可检测信号；
8、检测所述可检测信号，根据所述可检测信号的强度确定所述待测样品中端粒酶的活性。
9、进一步地，所述dnazyme核酸链为基于8-17 dnazyme催化核心的裂分型dnazyme核酸链，所述dnazyme核酸链识别所述底物链中的rag位点并在该位点切割所述底物链。
10、进一步地，所述dnazyme核酸链切割所述底物链的反应在二价金属离子存在下进行；所述二价金属离子为镁离子。
11、进一步地，所述底物链两端分别修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，所述底物链被切割后产生荧光信号；所述荧光基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。
12、进一步地，所述dnazyme核酸链切割所述底物链后从所述底物链上脱落，继续识别并切割新的底物链，循环产生信号。
13、进一步地，所述封闭裂分型dnazyme包含dnazyme核酸链和两条封闭链，所述dnazyme核酸链包括三条核酸链，所述两条封闭链与所述三条核酸链杂交组装，实现对所述封闭裂分型dnazyme的双重封闭。
14、进一步地，所述待测样品为细胞裂解液、组织样品、血液样品或临床活检样品。
15、进一步地，所述根据可检测信号的强度确定待测样品中端粒酶的活性，包括：将所述可检测信号的强度与预先建立的标准曲线进行比对，计算得到待测样品中端粒酶阳性细胞的数量；所述标准曲线以端粒酶阳性细胞数量为横坐标、以可检测信号强度为纵坐标。
16、本发明另一方面提供一种端粒酶活性检测试剂盒，包含：
17、功能性dna模块，所述功能性dna模块包含端粒酶引物和封闭裂分型dnazyme，所述端粒酶引物连接于所述封闭裂分型dnazyme，所述封闭裂分型dnazyme包含dnazyme核酸链和至少两条封闭链，所述dnazyme核酸链组装形成裂分的dnazyme催化核心，所述至少两条封闭链分别与所述dnazyme核酸链杂交，以抑制所述dnazyme核酸链的催化活性；
18、底物链，所述底物链可被具有催化活性的dnazyme核酸链切割；
19、反应缓冲液。
20、进一步地，所述检测试剂盒用于体外端粒酶活性检测或用于细胞内端粒酶活性的原位成像分析。
21、本发明的有益效果为：
22、本发明将端粒酶延伸反应、链置换反应与封闭裂分型dnazyme信号放大策略相结合，构建了一种恒温无酶端粒酶活性检测方法，具有以下有益效果：
23、（1）本发明无需蛋白酶参与，避免了传统trap法中蛋白酶带来的成本高、易产生假阴/假阳性等问题。dnazyme核酸链的催化活性依赖二价金属离子，无需精密控温设备，也无需依靠大型仪器或常见加热装置，在常温或生理温度下即可完成反应，具有简单经济的优势，操作简便，有利于临床推广。
24、（2）本发明采用至少两条封闭链与dnazyme核酸链杂交，对裂分的dnazyme催化核心进行多重封闭。与单条封闭链相比，至少两条封闭链协同锁定催化核心，有效抑制了封闭链因解链平衡而产生的非特异性泄漏，显著降低了空白背景信号，提高了检测信噪比。
25、（3）本发明以端粒酶作为唯一触发源，介导链置换反应并同步激活封闭裂分型dnazyme，实现端粒酶活性依赖的指数级荧光信号放大，使灵敏度与特异性由端粒酶自身决定，具备高特异性。封闭裂分型dnazyme的多重封闭结构进一步降低了非特异性激活的可能，使检测特异性由端粒酶自身决定，有效避免了复杂生物样品中非靶标物质的干扰。
26、（4）本发明所设计的dnazyme核酸链组装形成裂分的dnazyme催化核心，相较于传统单链dnazyme具有更高的切割效率。恢复催化活性的dnazyme核酸链可循环切割两端修饰有荧光基团和淬灭基团的底物链，每切割一轮即释放一个荧光信号，实现端粒酶活性依赖的信号放大，显著提高了检测灵敏度。
27、（5）本发明已成功应用于细胞实际样品及临床肿瘤组织和正常组织的端粒酶活性检测，具有良好的诊断性能和可靠性，有利于进一步挖掘端粒酶在临床诊断、预后评估及治疗监测中的应用价值。