一种用于同时检测螺杆菌的引物探针组合物及方法与流程

本发明属于螺杆菌生物检测，具体涉及一种用于同时检测螺杆菌的引物探针组合物及方法。

背景技术：

1、螺杆菌（helicobacter）感染是一个全球性问题，目前对幽门螺杆菌与人类疾病方面的研究较多，然而，对于螺杆菌属（helicobacter species）其他螺杆菌的研究则较少。已有研究发现，部分螺杆菌与人和动物的疾病发生密切相关，例如毕氏螺杆菌（helicobacterbizzozeronii）、海尔曼螺杆菌（helicobacter heilmannii）、猫螺杆菌（helicobacterfelis）、猪螺杆菌（helicobacter suis），广泛存在于人和动物的胃肠道中，被证实与人类和动物的胃肠疾病及多种疾病的发生密切相关，是人兽共患的致病菌。

2、毕氏螺杆菌（helicobacter bizzozeronii）是目前唯一从人体胃黏膜体外分离培养的非幽门螺杆菌的螺杆菌，是2008年kivisto等从一名幽门螺杆菌阴性有严重消化不良症状患者胃黏膜中成功分离培养得到，病理结果证实该菌与慢性活动性炎症有关。

3、海尔曼螺杆菌（helicobacter heilmannii）是螺杆菌属的一种革兰氏阴性螺旋形细菌，与幽门螺杆菌同属但形态差异显著。海尔曼螺杆菌于1993年首次在人的胃里发现，常定植于胃窦部，但因其检出率较低，长期未受足够关注。

4、猫螺杆菌（helicobacter felis）主要感染犬科和猫科动物，是目前研究较多的螺杆菌。albaret等的研究发现从动物体内分离的猫螺杆菌感染c57小鼠后可介导较幽门螺杆菌感染更为严重的胃黏膜炎症。

5、猪螺杆菌（helicobacter suis）是除幽门螺杆菌之外人体最主要、研究最多的螺杆菌，其自然宿主为猪、人和猴子。研究发现，60%猪胃内可见猪螺杆菌感染，其感染与猪非腺胃的溃疡及胃炎有关，可导致猪突然死亡、饲料摄入量减少和日增重减少。

6、尽管已有多种方法用于检测此类病原体，如培养法、免疫学方法等，但这些方法往往存在检测时间长、操作复杂、灵敏度和特异性有限等不足。分子生物学方法具有高灵敏度和特异性，适用于快速检测。聚合酶链式反应（pcr）通过设计特异性引物实现对这四种螺杆菌做出准确鉴定。

7、目前未发现针对上述四种螺杆菌的pcr检测相关技术，本发明基于四重荧光定量pcr（qpcr），通过设计特异性引物探针和优化pcr反应体系实现同时对毕氏螺杆菌、海尔曼螺杆菌、猫螺杆菌和猪螺杆菌作出鉴定。本发明提供的检测所述四种螺杆菌的方法在减少操作步骤和所需试剂的同时，还能显著提高检测效率和降低成本，为胃肠道疾病病因的快速诊断和充分预防提供强有力工具。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种用于同时检测毕氏螺杆菌、海尔曼螺杆菌、猫螺杆菌和猪螺杆菌的引物探针组合物；本发明的第二个目的是提供所述引物探针组合物在制备用于检测上述螺杆菌的产品中的用途；本发明第三个目的是提供一种用于检测上述螺杆菌的试剂盒；本发明还有一个目的是提供一种检测毕氏螺杆菌、海尔曼螺杆菌、猫螺杆菌和猪螺杆菌的方法。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供一种用于同时检测螺杆菌的引物探针组合物，所述螺杆菌为毕氏螺杆菌（helicobacter bizzozeronii）、海尔曼螺杆菌（helicobacterheilmannii）、猫螺杆菌（helicobacter felis）和猪螺杆菌（helicobacter suis）的组合，所述引物探针组合物由1）-4）所示的上下游引物和探针组成：

4、1）用于检测毕氏螺杆菌的上下游引物如seq id no:1和seq id no:2所示，探针如seq id no:3所示；

5、2）用于检测海尔曼螺杆菌的上下游引物如seq id no:4和seq id no:5所示，探针如seq id no:6所示；

6、3）用于检测猫螺杆菌的上下游引物如seq id no:7和seq id no:8所示，探针如seq id no:9所示；

7、4）用于检测猪螺杆菌的上下游引物如seq id no:10和seq id no:11所示，探针如seq id no:12所示。

8、进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。

9、本发明所述的“信号互不干扰”是指：上述各探针所用的荧光基团不同，且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用 fam、hex、rox、cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，不同通道的信号不会互相干扰；另外，每一种荧光通道的三个信号可以通过加入不同的探针浓度进行荧光值的区分，从而形成不同的聚类信号，并通过聚类分析软件进行进一步的区分，不会相互干扰。

10、在本发明的具体实施方式中，用于检测所述四种螺杆菌的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自fam、hex、rox和cy5。

11、第二方面，本发明提供一种本发明第一方面提供的引物探针组合物在制备用于检测螺杆菌产品中的用途。

12、所述螺杆菌为毕氏螺杆菌（helicobacter bizzozeronii）、海尔曼螺杆菌（helicobacter heilmannii）、猫螺杆菌（helicobacter felis）和猪螺杆菌（helicobactersuis）的组合。

13、所述用于检测螺杆菌的产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。

14、第三方面，本发明提供一种用于同时检测螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物探针组合物。

15、所述螺杆菌为毕氏螺杆菌（helicobacter bizzozeronii）、海尔曼螺杆菌（helicobacter heilmannii）、猫螺杆菌（helicobacter felis）和猪螺杆菌（helicobactersuis）的组合。

16、进一步的，所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、pcr缓冲液。

17、所述酶混合液中含有高保真taq酶、udg酶、镁离子、dntp中的至少一种。

18、所述阴性质控品为经焦炭酸二乙脂（depc）处理的纯水；阳性质控品为含有本发明所述的四种螺杆菌特定序列的质粒。

19、第四方面，本发明提供一种同时检测螺杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：

20、（1）提取待测样本dna或rna；

21、（2）配置含有本发明第一方面所述的引物探针组合物的pcr扩增体系进行pcr扩增反应；

22、（3）根据扩增曲线判断待测样本中是否存在相应的螺杆菌。

23、在步骤（2）中所述的扩增体系中，上游引物的终浓度为0.1-0.2µm，下游引物的终浓度为0.2-0.3µm，探针的终浓度为0.1-0.15µm。

24、本发明所述的待测样本为任何可能含有螺杆菌的物质，包括但不限于食品、粪便、口腔拭子、肛拭子。

25、基于实时荧光定量pcr技术，本发明提供一种同时检测四种螺杆菌（毕氏螺杆菌、海尔曼螺杆菌、猫螺杆菌和猪螺杆菌）的方法，通过对扩增引物和探针进行筛选和优化，剔除形成引物二聚体的引物组，对出现非特异性扩增的引物组进行人工改进，最终得到最佳的四重扩增体系，特异性好，灵敏度高。进一步，本发明将所述引物探针制备成可以同时检测所述四种螺杆菌的试剂盒，适用性强，为胃肠道疾病病因的快速诊断和充分预防提供强有力工具。