应用于复杂全血血样来源RNA扩增的反应体系、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及分子生物检测，尤其涉及一种应用于复杂全血血样来源rna扩增的反应体系、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）等核酸扩增技术为基因检测的常规手段，然而将此类技术应用于复杂全血血样的核酸样本时，其可靠性面临来自样本基质、反应动力学及靶标本身的多重严峻挑战。该类核酸样本成分极为复杂，不仅含有血红蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白等常见pcr抑制物[1]-[2]，更包含因全身性炎症反应或治疗引入的独特干扰物质，如中性粒细胞释放的弹性蛋白酶、抗生素（如庆大霉素）等，共同构成了“多重抑制物”的极端环境。这些物质不仅破坏扩增反应的化学微环境，更直接损伤酶活性与靶标核酸的完整性，常导致检测灵敏度不足、重复性差，甚至出现假阴性结果。

2、现有技术体系在应对这一复杂场景时存在多维度局限，且各项优化策略难以有效协同。首先，在ph动态稳定性方面，传统扩增反应广泛依赖的tris等缓冲体系，但tris等缓冲体系具有较高的温度系数，其ph值随反应升温过程会发生显著漂移。而复杂全血血样中的内源性物质（如乳酸、尿素）能通过化学反应进一步扰动h+浓度，与温度效应叠加，使体系ph严重偏离逆转录酶与dna聚合酶的最适活性区间。传统的离子添加剂（如硫酸铵、氯化钾）对此协同扰动的缓冲能力有限。

3、其次，在关键酶活性保护方面，常规稳定剂（如海藻糖、dtt）主要维持酶蛋白的结构稳定性，对于样本中特异性存在的蛋白酶降解威胁（如弹性蛋白酶）则无法提供主动防护。更为突出的挑战在于对复杂rna模板的兼容性严重不足。从复杂全血中提取的rna质量堪忧：一方面，残留的抑制物（如肝素、高盐离子）严重干扰引物退火与延伸的动力学过程；另一方面，样本中丰富的rna酶以及炎症相关的蛋白酶可能导致靶标rna发生降解或化学修饰，使其完整性受损。传统的引物设计通常针对纯净、完整的rna模板进行优化，在面对此类可能断裂、截短或带有非特异性结合的抑制物的“挑战性模板”时，其退火特异性与延伸效率显著下降，极易引发引物二聚体、非特异性扩增或扩增失败，这已成为制约检测灵敏度的核心瓶颈之一。

4、上述三大问题（ph的动态漂移、酶活性的被动失守以及引物与复杂模板的不兼容）并非孤立存在，而是在复杂全血血样中交织叠加、相互恶化。例如，非最优ph会进一步降低聚合酶对受损模板的延伸能力；而不匹配的引物延伸失败又会增加反应副产物，改变局部化学环境。现有技术方案多针对单一问题进行零散优化，若简单堆叠不同添加剂，各组分在复杂基质中可能产生难以预测的拮抗作用（如某些缓冲成分螯合关键的mg2+，而离子强度改变又影响引物退火），导致整体性能不升反降。

5、参考文献：

6、[1] inhibition and facilitation of nucleic acid amplication，1997；

7、[2] hughes等，2022，脓毒症相关病原体分子检测工具综述。

技术实现思路

1、鉴于上述存在的ph动态漂移、bicine对mg2+的螯合导致酶活性受损、以及样本中残留蛋白酶对靶标rna和功能酶造成降解的技术问题，本发明提供了一种应用于复杂全血血样来源rna扩增的反应体系、试剂盒及检测方法。本发明通过tris-bicine双缓冲体系协同维持ph稳定，并针对bicine螯合mg2+的特性配套优化镁盐浓度（4-8mm）以补偿被螯合的mg2+，确保酶活性充分激活；同时，通过添加aebsf（丝氨酸蛋白酶抑制剂）主动抑制样本中残留蛋白酶活性，保护靶标rna及逆转录酶、dna聚合酶的完整性，配合硫酸葡聚糖进一步稳定酶蛋白。上述组分的协同创新有效克服了现有技术在复杂全血血样检测中ph漂移、mg2+不足及蛋白酶降解的集成挑战，为实现快速、稳定、可靠的床旁分子诊断提供了关键技术支撑。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种用于复杂全血血样来源rna扩增的反应体系，所述反应体系包括缓冲组分和酶保护组分；

3、所述缓冲组分由tris和bicine组成，用于复杂全血血样来源rna扩增过程中协同维持反应体系ph值的稳定；

4、所述酶保护组分由aebsf和硫酸葡聚糖组成。

5、本发明中，tris与bicine构成的双缓冲体系中的bicine具有更低的pka温度系数，能有效抵消从低温储存到高温反应过程中因tris固有特性导致的ph负漂移。同时，该双缓冲体系对复杂全血血样中血红蛋白、尿素、乳酸等内源性抑制剂所释放或转化的h+具有更强的缓冲容量，能协同克服“温度漂移”与“样本化学干扰”的双重影响，将反应体系的ph动态稳定在逆转录酶与dna聚合酶的最适活性区间，从根本上保障了扩增效率的稳定性。

6、本发明中，本发明在常用稳定剂（海藻糖、dtt等稳定剂）基础上，增加aebsf（丝氨酸蛋白酶抑制剂）作为主动蛋白酶抑制剂，能从源头主动抑制复杂全血血样中特有的蛋白酶（如中性粒细胞弹性蛋白酶）活性，防止其对逆转录酶、dna聚合酶的降解，为反应提供“洁净”的酶工作环境。同时，协同添加的硫酸葡聚糖不仅能进一步稳定酶蛋白，还能提升扩增体系的局部浓度与效率。

7、示例性的，一种应用于复杂全血血样的rna扩增的反应体系，所述反应体系包括缓冲组分、酶保护组分以及引物探针组；

8、所述缓冲组分由tris（三羟甲基氨基甲烷）和bicine（n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸）组成，用于复杂全血血样的rna扩增过程中协同维持反应体系ph值的稳定；

9、所述酶保护组分由aebsf和硫酸葡聚糖组成。

10、上述示例中，tris与bicine构成的双缓冲体系中的bicine具有更低的pka温度系数，能有效抵消从低温储存到高温反应过程中因tris固有特性导致的ph负漂移。同时，该双缓冲体系对复杂全血血样中血红蛋白、尿素、乳酸等内源性抑制剂所释放或转化的h+具有更强的缓冲容量，能协同克服“温度漂移”与“样本化学干扰”的双重影响，将反应体系的ph动态稳定在逆转录酶与dna聚合酶的最适活性区间，从根本上保障了扩增效率的稳定性，且能兼容复杂rna模板。

11、示例性的，一种应用于复杂全血血样的rna扩增的反应体系，所述反应体系包括缓冲组分、酶保护组分以及针对stom基因、abhd14b基因和flt3lg基因的引物探针组；

12、所述缓冲组分由tris（三羟甲基氨基甲烷）和bicine（n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸）组成，用于复杂全血血样的rna扩增过程中协同维持反应体系ph值的稳定；

13、所述酶保护组分由aebsf和硫酸葡聚糖组成。

14、所述引物探针组为血流感染患者的全血血样中的stom基因、abhd14b基因和flt3lg基因的特异性引物及探针。

15、上述示例中，针对stom基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：1~3所示；针对abhd14b基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：4~6所示；针对flt3lg基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：7~9所示。

16、上述示例中，针对血流感染患者的全血血样的人源基因（如stom、abhd14b、flt3lg基因）的多组引物及探针。这些引物探针经过特殊设计与筛选，具有更高的特异性与退火稳定性。即使在样本rna存在部分降解、或残留抑制剂干扰的情况下，仍能有效结合目标序列，显著降低引物二聚体形成及非特异性扩增，从而提升对全血血样的复杂、低质量rna模板的兼容性与检测成功率，解决了传统引物在挑战性样本中灵敏度急剧下降的难题。

17、优选的，所述缓冲组分中，tris的终浓度为10-30mm，bicine的终浓度为30-50mm。

18、更加优选的，所述缓冲组分中，tris的终浓度为15-20mm，bicine的终浓度为30-45mm。

19、优选的，所述缓冲组分中，所述tris和bicine的摩尔比为1:(1.5-3)。

20、优选的，所述反应体系还包括4-8mm的镁盐。

21、需要说明的是，bicine在pcr反应过程中与pcr关键组分mg2+螯合，降低mg2+浓度；本发明通过高浓度的镁盐来补偿被螯合的mg2+。

22、优选的，所述酶保护组分中，aebsf的终浓度为0.1-1.0mm，硫酸葡聚糖的终质量体积浓度为0.01%-0.1%。

23、优选的，所述反应体系还包括dntps混合物、逆转录酶、热稳定dna聚合酶、核酸模板。

24、优选的，dntps混合物包括等浓度的datp、dttp、dctp和dgtp，浓度各为0.2-0.5mm。

25、示例性的，dntps混合物的浓度为（datp、dttp、dctp和dgtp）各0.3mm，逆转录酶的浓度为1mm，热稳定dna聚合酶的浓度为1mm，核酸模板的浓度为20mm。

26、优选的，所述反应体系在25℃下的ph值为8.30-8.72。

27、更加优选的，所述反应体系在25℃下的ph值为8.40-8.60。

28、优选的，所述反应体系还包括et ssb蛋白（(超高耐热单链dna结合蛋白），终浓度为3.5-5.0ng/μl。

29、本发明中，et ssb蛋白在pcr高温变性阶段，它优先结合并稳定解旋后的单链dna，防止其重新退火或形成二级结构，从而为引物结合扫清障碍。同时，它通过与dna聚合酶的物理互作，增强聚合酶对引物/模板复合物的结合能力与持续合成能力，显著提升延伸效率。其超热稳定性确保了在95℃高温下仍能全程发挥功能。et ssb蛋白能够吸附复杂全血样本中的干扰抑制物（如血红蛋白、igg），从而保护核酸模板，降低其对聚合酶的负面影响。

30、基于同一发明构思，本发明还提供了一种用于复杂全血血样来源rna扩增的试剂盒，包括上述任一所述的应用于复杂全血血样来源rna扩增的反应体系。

31、优选的，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

32、优选的，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、杂质洗涤纯化试剂。

33、优选的，所述试剂盒还包括stom基因、abhd14b基因、flt3lg基因的特异性引物及探针。

34、上述示例中，针对stom基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：1~3所示；针对abhd14b基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：4~6所示；针对flt3lg基因的上游引物、下游引物和探针依次如seq id no：7~9所示。

35、基于同一发明构思，本发明还提供了一种非诊断目的的多基因的检测方法，使用上述任一所述的应用于复杂全血血样来源rna扩增的反应体系或上述所述的试剂盒，对待测全血血样来源的rna进行逆转录及实时荧光pcr扩增；其中，所述多基因为stom基因、abhd14b和flt3lg基因。

36、在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否存在血流感染等疾病的信息。例如，可以在检测培养物中(例如血液等)检测是否有上述相关目的基因表达。

37、优选的，复杂全血血样来源rna（核酸样本）的提取方法为采用磁珠法进行提取（本领域的常用rna提取方法）。

38、示例性的，复杂全血血样的rna提取方法，包括以下步骤：

39、（1）样本预处理与裂解释放：取100-200μl复杂全血血样，与含有蛋白变性剂（如异硫氰酸胍）及表面活性剂的裂解缓冲液按体积比1:3至1:5混合，涡旋振荡充分。在室温（15-25℃）下静置5-10分钟，以彻底破坏细胞膜及核膜，并使蛋白质变性，从而将细胞内的总核酸（包括dna和rna）释放到裂解液中；

40、（2）核酸与磁珠的特异性结合：向裂解混合物中加入经硅羟基或羧基修饰的磁性纳米微球（磁珠）悬浮液20-50μl，以及促进结合的高浓度醇类溶液（如异丙醇，终浓度约20-40%）。在室温下翻转混合10-15分钟。在此过程中，溶液的高盐和醇环境使核酸因脱水而暴露磷酸骨架，通过氢键和阳离子桥作用特异性吸附于磁珠表面，而变性的蛋白质等杂质则留在溶液中；

41、（3）杂质的多步洗涤与纯化：利用外置磁场固定磁珠-核酸复合物，弃去上清液。依次进行两至三次洗涤：第一次洗涤：使用含高浓度离液盐（如盐酸胍）和醇的洗涤缓冲液，旨在去除残留的蛋白质和脂类杂质；第二次洗涤：使用70-80%的乙醇溶液，目的是彻底去除盐离子和残留的有机溶剂。每次洗涤时，需将磁珠充分重悬于洗涤液中并静置约30秒，再通过磁场分离，以确保纯化效果。

42、（4）核酸的洗脱与保存：将洗涤后的磁珠复合物在室温下开盖静置3-5分钟，使残留乙醇完全挥发。加入50-100μl无核酸酶水或低浓度tris-edta缓冲液（ph 8.0-8.5），于55-65℃温育5-10分钟，并间歇涡旋。此条件下，低离子强度的洗脱液破坏核酸与磁珠间的氢键，使高纯度的核酸溶解于洗脱液中。最终，在磁场作用下收集含有核酸的上清液，立即置于-70℃及以下超低温环境长期保存，以防止核酸（尤其是rna）降解。

43、需要说明的是，本技术的复杂全血血样指代具有一定疾病的患者的全血血样，比如：血流感染患者的全血血样等。其反义词为健康人的全血血样。

44、优选的，所述逆转录的反应温度为55℃，时间为15min；所述实时荧光pcr扩增的反应包括95℃预变性5min，95℃变性1min，65℃退火及延伸40s。

45、与现有技术相比，本发明的有益效果：

46、（1）本发明采用由tris与bicine构成的双缓冲体系，创造性替代了传统的“单一tris缓冲液+铵盐/钾盐”方案。bicine具有更低的pka温度系数，能有效抵消从低温储存到高温反应过程中因tris固有特性导致的ph负漂移。同时，该双缓冲体系对复杂全血血样的核酸样本中血红蛋白、尿素、乳酸等内源性抑制剂所释放或转化的h+具有更强的缓冲容量，能协同克服“温度漂移”与“样本化学干扰”的双重影响，将反应体系的ph动态稳定在逆转录酶与dna聚合酶的最适活性区间，从根本上保障了扩增效率的稳定性；

47、（2）本发明特别设计了针对stom基因、abhd14b基因、flt3lg基因的多组引物及探针。这些引物探针经过特殊设计与筛选，具有更高的特异性与退火稳定性。即使在样本rna存在部分降解、或残留抑制剂干扰的情况下，仍能有效结合目标序列，显著降低引物二聚体形成及非特异性扩增，从而提升对复杂全血来源的复杂、低质量rna模板的兼容性与检测成功率，解决了传统引物在挑战性样本中灵敏度急剧下降的难题；

48、（3）本发明在常用稳定剂（海藻糖、dtt等稳定剂）基础上，增加aebsf（丝氨酸蛋白酶抑制剂）作为主动蛋白酶抑制剂，能从源头主动抑制复杂全血血样中特有的蛋白酶（如中性粒细胞弹性蛋白酶）活性，防止其对逆转录酶、dna聚合酶的降解，为反应提供“洁净”的酶工作环境。同时，协同添加的硫酸葡聚糖不仅能进一步稳定酶蛋白，还能提升扩增体系的局部浓度与效率。针对本发明中的bicine螯合mg2+的特性，本发明通过配套提供优化后的mg2+浓度范围予以补偿，确保了各组分在协同作用下的整体平衡与高效性。