一种检测玉米小斑病菌的RPA-LFD引物对探针组合、试剂盒、应用和检测方法

本发明涉及植物病害检测，特别是涉及一种检测玉米小斑病菌的rpa-lfd引物对探针组合、试剂盒、应用和检测方法。

背景技术：

1、玉米小斑病是玉米叶斑病中一种典型的叶部重要真菌性病害。

2、玉米小斑病的正确诊断是病害有效防治的基本提前，因此，建立玉米小斑病菌快速、准确和操作简便的检测方法具有重要的实践意义。传统的玉米病原菌鉴定方法主要包括病原菌的分离和基于形态学特征与分子生物学技术的物种鉴定，其程序繁琐、耗时费力且需要较强的专业知识背景，因此传统的病原体鉴定具有极大的局限性。近年来，随着生物技术的快速发展，基于核酸的检测技术已经应用于植物病原菌的检测，包括常规 pcr、实时荧光定量pcr、巢 式pcr、核酸杂交和环介导等温扩增技术等分子生物学检测技术，但这些技术复杂且需要昂贵的材料和设备，难以直接应用于田间。相对而言，重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa）技术对模板完整性、反应温度或时间等没有严格的需求，因此在发展便携式核酸检测方面具有显著的应用潜力。同时，rpa扩增产物可以与侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，lfd）、荧光染料等结合实现快速可视化。目前，rpa-lfd技术已经成功应用于多种有害生物的检测，如阿卡斑病毒、小麦矮腥黑粉菌、塔玛亚历山大藻和马铃薯腐烂茎线虫等。但关于玉米小斑病菌rpa-lfd检测技术的研究以及在田间的应用尚未见报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种检测玉米小斑病菌的rpa-lfd引物对探针组合、试剂盒、应用和检测方法，本发明基于bipolaris maydis还原酶基因[reductase(brn1) gene]序列（登录号: mt130208.1），设计用于b. maydis rpa-lfd检测的特异性引物和探针，通过对反应条件（温度、时间）优化，建立了b. maydis的快速可视化 rpa-lfd检测体系，进一步对该检测方法的特异性与灵敏度进行评估，并基于对田间疑似样品的检测效果进行验证，以期为玉米小斑病的田间快速诊断提供特异性强、敏度高、操作简快捷、检测结果可视化的一种检测方法。

2、本发明通过比对玉米小斑病菌（bipolaris maydis）还原酶基因[reductase(brn1) gene]序列（登录号: mt130208.1）的特异区域，根据rpa引物和探针设计原则，设计b. maydis pra-lfd反应特异性引物bmf3/bmr3和探针bm-probe，在rpa反应体系的优化的基础上，建立了b. maydis pra-lfd 检测方法，对所建立的b. maydis pra-lfd的特异性、灵敏度和应用性进行了测试和评估，最终建立了适用于快速检测b. maydis的rpa-lfd检测方法。

3、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、本发明提供了一种检测玉米小斑病菌的rpa-lfd引物对探针组合，包括引物bmf3、引物bmr3和探针bm-probe；

5、所述引物bmf3的核苷酸序列如seq id no.1所示；

6、所述引物bmr3的核苷酸序列如seq id no.2所示；

7、所述探针bm-probe的核苷酸序列如seq id no.3所示。

8、优选的，所述引物bmr3的5'末端标记biotin；

9、所述探针bm-probe 5'末端添加有荧光基团6-fam，3'末端添加有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团c3-spacer，且在探针中距离5'端30 bp处碱基由四氢呋喃替代。

10、本发明还提供了一种检测玉米小斑病菌的rpa-lfd试剂盒，包括上述技术方案所述的rpa-lfd引物对探针组合。

11、本发明还提供了上述技术方案所述的rpa-lfd引物对探针组合或上述技术方案所述的rpa-lfd试剂盒在检测玉米小斑病菌中的应用。

12、本发明还提供了一种检测玉米小斑病菌的方法，包括以下步骤：

13、1）提取待检测样品的基因组dna；

14、2）以步骤1）所述基因组dna为模板，经上述技术方案所述rpa-lfd引物对探针组合进行rpa扩增，得到扩增产物；

15、3）将步骤2）所述扩增产物与检测缓冲液混合，得到混合液，将lfd试纸条的检测端垂直浸入所述混合液中，当所述lfd试纸条出现2条紫红色条带时，检测出玉米小斑病菌。

16、优选的，步骤1）所述待检测样品包括玉米叶片。

17、优选的，步骤2）所述rpa扩增的体系为：rehydration buffer 29.5 μl，10 μmol/l引物bm3f 2.1 μl，10 μmol/l引物bm3r 2.1 μl，10 μmol/l探针bm probe 0.6 μl，基因组dna 1.0 μl，无菌双蒸水12.2 μl，将上述组分混匀后加入到rpa冻干酶粉中，随后加入280mmol/l醋酸镁2.5 μl。

18、优选的，步骤2）所述rpa扩增的反应条件为：于38℃温育4 min后，混匀后稍离心，继续38℃温育26 min。

19、优选的，步骤3）所述扩增产物与检测缓冲液的体积比为1:19；

20、所述lfd试纸条的检测端垂直浸入混合液中的时间为5min。

21、优选的，步骤3）为确保检测结果准确性，将所述扩增产物与等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合，在12000g下离心5min，将上清液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，当扩增出单一条带时，检测出玉米小斑病菌；所述苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

22、本发明的有益效果：

23、(1)特异性强、精准度高：本发明通过比对玉米小斑病菌（bipolaris maydis）还原酶基因[reductase (brn1) gene]序列（登录号: mt130208.1）的特异区域，根据rpa引物和探针设计原则，设计b. maydis pra-lfd反应特异性引物bmf3/bmr3和探针bm-probe，在rpa反应体系的优化的基础上，建立了b. maydis pra-lfd 检测方法，本发明对玉米常见病原菌进行检测，只有玉米小斑病菌检测结果为阳性，其余病原菌均为阴性，特异性和准确度都极高。

24、 (2)灵敏度高：本发明的dna检测限为1 pg/μl，灵敏度显著高于常规pcr和lamp。

25、 (3)检测高效、快速：rpa扩增体系在38℃条件下可以进行双链dna的扩增，最快30min就可以得到一个可视化的结果，克服了常规pcr和lamp耗时长的缺点。

26、 (4)操作简便、无需特殊设备、适用性强：本发明可以检测玉米叶片中是否携带含有玉米小斑病菌（bipolaris maydis），对玉米小斑病的早期诊断、检验检疫、预测预报和精准防控具有重要意义，克服了pcr检测需要复杂的仪器设备，耗时较长等缺点，适用于基层或现场的快速检测，具有重要的实际应用价值。

27、 (5)结果稳定、易懂：本发明中检测结果通过质控线与检测线判读呈现，结果显示稳定且简单易懂，克服了lamp检测在田间由于光照等原因造成颜色辨别不明显、结果显示不稳定等缺点。

28、综上，本发明能准确监测玉米植株中是否含有玉米小斑病菌（bipolarismaydis），并克服常规pcr、lamp检测方法检测时间长、价格昂贵(且携带不便)、操作复杂、结果不稳定等缺点，具有特异性强、灵敏度高、操作简便和时效高等优点。可以用该发明对田间玉米小斑病菌进行高效精准的特异性检测，为精准防控提供理论依据。