基于RPA-CRISPRCas12a快速检测内/外源性禽白血病毒的试剂盒及检测方法

本发明涉及生物，具体而言，涉及基于rpa-crisprcas12a快速检测内/外源性禽白血病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、禽白血病（avian leukosis，al）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus，alv）引起的一种禽类肿瘤性疾病的统称，可导致鸡群发生淋巴肉瘤、髓样细胞瘤、血管瘤等，给全球养鸡业造成巨大的经济损失。国际动物卫生组织和我国农业农村部均将其列为重点防控的疫病。自20世纪以来，alv在世界各地广泛流行，尤其1999年我国首次分离鉴定出j亚群禽白血病病毒（alv-j）后，该亚群已成为危害我国养鸡业的主要外源性alv。

2、alv防控至今仍无有效的疫苗和治疗药物，早期检测和净化是控制该病的主要手段。目前，alv的检测方法主要包括病毒分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测。病毒分离鉴定是世界动物卫生组织（oie）推荐的诊断“金标准”之一，但该方法耗时长（通常需要数周）、操作繁琐，且对实验人员和实验室生物安全等级要求高，不适用于大规模的现场筛查。血清学检测如elisa方法，虽然操作简单、适合高通量检测，但易受内源性alv（alv-e）表达的p27抗原干扰，导致假阳性结果，特异性较差，难以精准区分外源性感染与内源性污染。以pcr和qpcr为代表的分子生物学检测方法具有灵敏度高、特异性强的优点，是目前实验室诊断的主流技术，但其依赖精密的热循环仪器和专业操作人员，检测成本较高，难以满足现场快速检测的需求。新兴的等温扩增技术如lamp，虽具有操作简单、无需复杂仪器的优点，但引物设计复杂，且容易出现非特异性扩增导致的假阳性问题。

3、crispr-cas系统是近年来发展起来的新型核酸检测技术，在病原体快速检测领域展现出巨大潜力。该系统利用特异性crrna引导cas蛋白（如cas12a）识别靶标核酸，激活cas蛋白的附带切割活性，无差别地切割体系中的荧光报告分子，从而实现信号的放大与转换。相较于传统pcr技术，基于crispr-cas的检测方法具有反应快速、操作便捷、成本低廉、无需昂贵仪器的优点，具备开发成现场即时检测（poct）工具的巨大潜力。

技术实现思路

1、基于此，本发明要解决的问题是克服现有禽白血病病毒（alv）检测技术中存在的耗时长、依赖贵重仪器、无法鉴别内外源性、难以现场应用等缺陷和不足。本发明的目的在于提供一种仪器依赖性小、操作快速简单、灵敏度高且特异性好，并能有效鉴别外源性alv-j与内源性alv-e的现场快速检测方法，对禽白血病的早期诊断、精准防控和净化具有重要意义。本发明提供了基于rpa-crisprcas12a快速检测内/外源性禽白血病毒的试剂盒及检测方法，具体技术方案如下：

2、本发明提供基于rpa-crisprcas12a快速检测内/外源性禽白血病毒的试剂盒，所述试剂盒包括crrna引物，所述crrna引物的序列如seq id no.1-20所示。

3、进一步地，所述crrna引物在制备禽白血病毒检测产品中的应用。

4、进一步地，所述试剂盒还包括rpa扩增引物对，所述rpa扩增引物对的序列如seqid no.21-38所示。

5、进一步地，所述试剂盒还包括ssdna reporter，其序列为5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

6、进一步地，所述试剂盒还包括除所述crrna、rpa扩增引物对、ssdna报告分子以外的rpa扩增体系和crispr/cas12a检测体系所需试剂。

7、另外，本发明还提供一种基于rpa-crisprcas12a快速检测禽白血病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

8、(a) 提取待测样本的rna，使用rpa引物对进行rt-rpa扩增，获得扩增产物；

9、(b) 将所述扩增产物与crispr/cas12a检测体系混合，所述检测体系包含cas12a蛋白、权利要求1所述的crrna和荧光报告分子；

10、(c) 孵育后检测荧光信号，根据荧光信号判断是否存在禽白血病病毒以及区分内源性或外源性。

11、进一步地，步骤（a）中rt-rpa扩增反应条件为：37℃~42℃下反应20min~40min；步骤（b）中的孵育条件为：37℃~40℃下反应20min~40min。

12、进一步地，所述禽白血病病毒为外源性j亚群禽白血病病毒和/或内源性禽白血病病毒。

13、所述的试剂盒在制备禽白血病毒检测产品、或非诊断目的的禽白血病毒检测中的应用。

14、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

15、1.本发明建立的检测方法对alv-j和alv-e的rna标准品检出限均可达50 copies/μl，能够满足感染早期的检测需求，有助于实现禽白血病的早期防控。

16、2.本发明方法能够特异性识别alv-j和alv-e，与常见共感染病毒（如mdv1、rev）及其他alv亚群（alv-a、alv-b、alv-k）均无交叉反应（参见实施例8及图5）。同时，通过针对不同靶标设计特异性crrna和rpa引物，实现了外源性alv-j与内源性alv-e的有效鉴别，克服了传统血清学方法因内源性p27抗原干扰导致的假阳性问题，并有助于疫情的早期发现与干预。

17、3.本发明采用两步法检测（30minrt-rpa扩增+30mincrispr/cas12a切割），全程可在60分钟内完成，显著优于荧光定量pcr（通常需1.5-2h），更适用于现场快速筛查和临床即时检测，且准确性高。

18、4.本发明不依赖精密的热循环仪，仅需水浴锅或恒温培养箱（42℃及40℃）以及蓝光仪即可完成检测和结果判读，对操作人员和实验室环境要求低，成本低廉，适合在基层养殖场、口岸检疫等一线场所推广应用。确定了针对alvj和alve靶标的最优crrna（seq idno.3、no.7、no.16等）及rpa引物对（alvj：f4/r5；alve：f3/r1），确保了检测体系的高效性、灵敏度和特异性，为crisprcas12a技术在禽白血病检测领域提供了最优的核心组件。

19、5.本发明不依赖精密的热循环仪，仅需水浴锅或恒温培养箱（42℃及40℃）以及蓝光仪即可完成检测和结果判读，对操作人员和实验室环境要求低，成本低廉，适合在基层养殖场、口岸检疫等一线场所推广应用，整体上，克服了现有alv检测技术耗时长、依赖贵重仪器、无法鉴别内外源性、难以现场应用等缺陷，为禽白血病的早期诊断、精准防控和净化提供了简便、快速、灵敏且特异的新工具，具有良好的社会应用前景和产业化价值。

1.基于rpa-crisprcas12a快速检测内/外源性禽白血病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括crrna引物，所述crrna引物的序列如seq id no.1-20所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述crrna引物在制备禽白血病毒检测产品中的应用。

3.一种基于rpa-crisprcas12a快速检测禽白血病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的crrna引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括rpa扩增引物对，所述rpa扩增引物对的序列如seq id no.21-38所示。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ssdna reporter，其序列为5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括除所述crrna、rpa扩增引物对、ssdna报告分子以外的rpa扩增体系和crispr/cas12a检测体系所需试剂。

7.一种基于rpa-crisprcas12a快速检测禽白血病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（a）中rt-rpa扩增反应条件为：37℃~42℃下反应20min~40min；步骤（b）中的孵育条件为：37℃~40℃下反应20min~40min。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述禽白血病病毒为外源性j亚群禽白血病病毒和/或内源性禽白血病病毒。

10.权利要求1所述的crrna、权利要求3~6任一项所述的试剂盒或权利要求7~9任一项所述的方法在制备禽白血病毒检测产品、或非诊断目的的禽白血病毒检测中的应用。