一种软毛青霉酸单克隆抗体、快速检测试纸条及其制备方法与流程

本发明涉及单克隆抗体与体外检测，特别涉及一种软毛青霉酸单克隆抗体、快速检测试纸及其制备方法。

背景技术：

1、2024年日本小林制药公司向日本厚生劳动省报告中指出其红曲产品中导致问题的成分可能为“软毛青霉酸（puberulic acid）”。软毛青霉酸是在发酵过程中由青霉菌产生的天然毒素。软毛青霉酸（pa）目前没有标准的检测方法，一般采用仪器方法进行检测，例如高效液相色谱，气相色谱，液相色谱-质谱联用技术（lc-ms/ms）等技术。这些方法依赖大型仪器，操作复杂，需要专业的技术人员，检测时间长，检测成本高。现有技术中暂无方便快捷的检测方法，因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现思路

1、本发明旨在解决上述问题，提供了以下的技术方案，具体如下：

2、第一方面，本发明提供了一种特异性结合软毛青霉酸单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

3、进一步的，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株3h8产生，所述杂交瘤细胞株3h8（hybridoma cell line 3h8），于2026年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no: c2026137，保藏地址为：中国湖北省武汉市武汉大学。

4、第二方面，本发明提供了如第一方面所述的一种特异性结合软毛青霉酸单克隆抗体在检测软毛青霉酸中的应用。

5、第三方面，本发明提供了一种软毛青霉酸快速检测试纸条，包括底板以及依次搭接设置在底板上的样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

6、所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有软毛青霉酸-载体蛋白偶联物，所述质控线上包被有抗鼠igg抗体；

7、所述标记垫上包被有标记物标记的权利要求1所述的单克隆抗体。

8、进一步的，所述标记物为胶体金颗粒、时间分辨荧光微球、羧基化彩色微球或荧光量子点微球。

9、第四方面，本发明提供了一种根据第三方面所述的软毛青霉酸快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

10、s1：将软毛青霉酸-载体蛋白偶联物和抗鼠igg抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，干燥后得到包被膜；

11、s2：将第一方面所述的单克隆抗体与标记物偶联，得到标记抗体，并将标记抗体喷涂或浸泡于标记垫上，干燥；

12、s3：将样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸依次搭接粘贴于底板上，切割成型，得到快速检测试纸条。

13、进一步的，所述步骤s1中，所述软毛青霉酸-载体蛋白偶联物的浓度为0.01～0.1mg/ml，所述抗鼠igg抗体的浓度为0.1～0.5 mg/ml。

14、进一步的，所述标记物为时间分辨荧光微球，步骤s2中所述偶联包括以下操作：用edc和nhs活化微球后，加入单克隆抗体反应，再加入牛血清白蛋白封闭。

15、第五方面，本发明还提供了一种检测软毛青霉酸的方法，包括使用第一方面所述的单克隆抗体或第三方面所述的试纸条对待测样本进行检测的步骤。

16、进一步的，所述检测为定性检测或定量检测；所述定性检测采用胶体金标记的试纸条，通过肉眼观察检测线显色进行判断；所述定量检测采用荧光标记的试纸条，配合荧光检测仪读取信号值。

17、本发明具有如下有益效果：

18、1、本发明首次提供了一种高灵敏度的软毛青霉酸特异性单克隆抗体，通过杂交瘤技术筛选获得一株稳定分泌抗软毛青霉酸抗体的杂交瘤细胞株3h8，其分泌的抗体对软毛青霉酸的半数抑制浓度（ic50）低至1.6 ng/ml，具有极高的亲和力和特异性，为软毛青霉酸的免疫学检测提供了核心原料。

19、2、基于本发明抗体开发的胶体金定性试纸条，操作简单，无需任何仪器设备，加样后10分钟内即可肉眼判读结果，适用于现场快速筛查，克服了传统液相色谱-质谱联用法（lc-ms/ms）依赖大型仪器、操作复杂、检测时间长、成本高的缺陷。

20、3、本发明基于时间分辨荧光微球标记的荧光定量试纸条，配合便携式荧光检测仪，可在8分钟内完成定量检测。实际样品加标回收实验结果显示，在红曲样品中软毛青霉酸添加量为3~100 ng/g时，荧光定量试纸条的回收率为91.0%~108.1%，与lc-ms/ms检测结果的回收率（80.3%~116.2%）高度一致，表明本发明定量检测结果准确可靠。

21、4、本发明针对软毛青霉酸检测方法缺失问题，填补了该毒素快速免疫检测技术的空白，为红曲及其相关产品中软毛青霉酸的日常监测、风险预警及应急处置提供了简便、快速、经济的检测手段。

1.一种特异性结合软毛青霉酸单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种特异性结合软毛青霉酸单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株3h8产生，所述杂交瘤细胞株3h8的保藏编号为：cctcc no:c2026137。

3.如权利要求1所述的一种特异性结合软毛青霉酸单克隆抗体在检测软毛青霉酸中的应用。

4.一种软毛青霉酸快速检测试纸条，其特征在于，包括底板以及依次搭接设置在底板上的样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

5.根据权利要求4所述的一种软毛青霉酸快速检测试纸条，其特征在于，所述标记物为胶体金颗粒、时间分辨荧光微球、羧基化彩色微球或荧光量子点微球。

6.一种根据权利要求4所述的软毛青霉酸快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述软毛青霉酸-载体蛋白偶联物的浓度为0.01～0.1 mg/ml，所述抗鼠igg抗体的浓度为0.1～0.5 mg/ml。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述标记物为时间分辨荧光微球，步骤s2中所述偶联包括以下操作：用edc和nhs活化微球后，加入单克隆抗体反应，再加入牛血清白蛋白封闭。

9.一种检测软毛青霉酸的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求4所述的试纸条对待测样本进行检测的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述检测为定性检测或定量检测；所述定性检测采用胶体金标记的试纸条，通过肉眼观察检测线显色进行判断；所述定量检测采用荧光标记的试纸条，配合荧光检测仪读取信号值。