一种用于东方白鹳DNA快速检测的RPA-nfo引物探针组合、包含该组合的试剂盒及检测方法

本发明属于分子生物学和物种检测，具体涉及一种用于东方白鹳dna快速检测的rpa-nfo引物探针组合、包含该组合的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、东方白鹳（ciconia boyciana）是重要珍稀鸟类，其种群分布、迁飞停歇、栖息地利用和活动区域监测，对湿地保护、生物多样性调查、迁飞通道管理以及生态修复评估具有重要意义。在湿地巡护、生态修复区管理和重点保护物种调查中，快速判断东方白鹳是否出现或是否留下可检测的遗传信息，有助于为保护管理提供及时依据。

2、现有东方白鹳监测主要依赖人工观察、望远镜观察、红外相机、视频监控、痕迹调查以及巡护记录等方式。上述方法直观、基础性强，但容易受到天气、光照、地形、植被遮挡、目标个体活动状态、停留时间以及调查人员经验等因素影响。对于低密度、短暂停歇、远距离活动或隐蔽活动的个体，传统观察方法可能存在漏检或确认依据不足的问题。

3、随着分子生态学和环境dna技术的发展，pcr、qpcr、测序和宏条形码分析等dna检测方法已被用于目标物种识别和环境样品分析。该类方法准确性较好，适合实验室结果确认和科研分析，但通常需要核酸提取设备、热循环仪、荧光定量pcr仪、电泳成像系统或测序平台，并依赖专业人员操作，样品还需保存、运输和排队检测，整体周期较长，不利于现场快速筛查和即时判断。

4、重组酶聚合酶扩增（rpa）是一种恒温核酸扩增技术，可在较低恒定温度下实现目标核酸片段扩增。rpa-nfo体系进一步使用带有5'fam、内部idsp和3'c3 spacer修饰的nfo探针，以及带有5'biotin修饰的引物，使扩增产物形成fam/biotin双标记结构。该双标记扩增产物可通过胶体金试纸条进行可视化识别，从而通过质控线和检测线进行肉眼判断。

5、目前，rpa、mira、lamp及胶体金试纸条等快速检测技术已在病原检测、食品来源鉴别和部分物种识别中应用，但针对东方白鹳这一具体物种的rpa-nfo胶体金快速检测引物探针组合和试剂盒仍缺乏专门化、经实验筛选的方案。因此，需要开发一种针对东方白鹳eu263930.1相关靶序列的rpa-nfo快速可视化检测体系。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于东方白鹳dna快速检测的rpa-nfo引物探针组合、包含该组合的试剂盒及检测方法，以解决现有检测方法依赖复杂设备、操作繁琐、周期长、不适用于现场快速筛查的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、第一方面，本发明提供了一种用于东方白鹳dna快速检测的rpa-nfo引物探针组合，所述组合为组合1-2或组合2-2；

4、所述组合1-2包括：上游引物probepanel_1_2_f，其序列为seq id no:5；下游引物probepanel_1_2_r，其序列为seq id no:6，且所述下游引物的5′端带有biotin修饰；以及探针probepanel_1_1_probe，其序列为seq id no:4，且所述探针的5′端带有6-fam修饰，内部含有idsp位点，3′端为c3 spacer封闭；

5、所述组合2-2包括：上游引物probepanel_2_2_f，其序列为seq id no:10；下游引物probepanel_2_2_r，其序列为seq id no:11，且所述下游引物的5′端带有biotin修饰；以及探针probepanel_2_1_probe，其序列为seq id no:9，且所述探针的5′端带有6-fam修饰，内部含有idsp位点，3′端为c3 spacer封闭。

6、第二方面，本发明提供了一种东方白鹳dna快速检测用试剂盒，包含本发明提供的引物探针组合，以及用于rpa-nfo扩增的试剂和/或胶体金试纸条。

7、进一步的，本发明试剂盒所述胶体金试纸条为侧向层析试纸条。

8、第三方面，本发明提供了一种东方白鹳dna快速检测方法，包括以下步骤：

9、（1）制备待测dna模板；

10、（2）配制rpa-nfo反应体系，所述体系中含有本发明提供的引物探针组合中的任一组；

11、（3）加入所述dna模板，在恒温条件下进行扩增反应；

12、（4）将扩增产物稀释后，加入胶体金试纸条进行显色；

13、（5）根据试纸条质控线和检测线的显色情况，判断样品中是否含有东方白鹳dna。

14、进一步的，本发明方法所述恒温扩增的温度为37-42℃，扩增时间为15-20分钟。

15、进一步的，本发明方法所述rpa-nfo反应体系为50 μl体系，其组成包括：adbuffer 29.4 μl，10 μm上游引物2 μl，10 μm下游引物2 μl，10 μm探针0.6 μl，模板和ddh2o共13.5 μl，b buffer 2.5 μl。

16、进一步的，本发明方法步骤（4）中所述稀释为用ddh2o或试纸条指定稀释液稀释10-20倍。

17、进一步的，本发明方法步骤（5）的判断标准为：质控线和检测线均显色判定为阳性，仅质控线显色判定为阴性，质控线不显色判定为检测无效。

18、本发明以东方白鹳eu263930.1相关合成靶片段重组质粒为阳性模板进行基础型rpa电泳验证后，组合1-2和组合2-2在琼脂糖凝胶电泳中均出现明确扩增条带。每个组合均进行了两次重复，结果显示上述两个组合的扩增条带重复性较好，提示其在阳性模板条件下能够扩增东方白鹳目标片段。

19、在阴性验证实验中，组合1-1、2-1和3-1在不同位置出现条带，可能为引物二聚体或非特异性扩增条带。相比之下，组合1-2和组合2-2的阴性结果较干净，未见明显干扰条带，因此更适合作为后续东方白鹳rpa-nfo胶体金试纸条检测的优选组合。

20、在rpa-nfo胶体金试纸条阳性实验中，仅测试组合1-2和组合2-2。每个组合设置3个重复，在东方白鹳阳性模板条件下均可观察到清晰的c线和t线，说明上述两个组合能够在rpa-nfo胶体金试纸条体系中实现对东方白鹳靶片段的可视化检测。

21、与传统pcr、qpcr或测序方法相比，本发明采用恒温扩增和胶体金试纸条判断，具有反应条件相对简单、结果可视化、设备依赖较低和适合后续现场快速筛查开发的特点。与未经筛选的候选组合相比，组合1-2和2-2基于阳性扩增、阴性验证和试纸条显色三类实验结果显示出更好的应用潜力。

22、本发明的技术效果是：

23、（1）本发明首次筛选出针对东方白鹳eu263930.1靶序列的特异性rpa-nfo引物探针组合，通过阳性扩增、阴性验证和试纸条显色三重实验验证，证明组合1-2和2-2具有高特异性和灵敏度。

24、（2）本发明采用恒温扩增（37-42℃）和胶体金试纸条肉眼判断，无需热循环仪、荧光定量pcr仪、电泳成像系统或测序平台，操作简便，适合野外或基层现场快速检测。

25、（3）本发明可直接应用于环境dna样品或组织dna的快速筛查，为东方白鹳种群监测和保护管理提供便捷分子工具。检测周期短，实现了对东方白鹳dna的快速检测。