一种集成短时培养与信号增敏技术的高灵敏快速检测菌落总数的方法

本发明属于食品检测，具体涉及一种集成短时培养与信号增敏技术的高灵敏快速检测菌落总数的方法。

背景技术：

1、菌落总数是评价食品卫生质量、监控生产过程及企业产品放行的核心微生物指标，其检测效率直接影响食品安全监管的时效性与准确性。如：酱油作为传统发酵调味品，菌落总数超标情况屡见不鲜，微生物超标会给企业与消费者带来不可挽回的巨大损失。根据gb 2717-2018《食品安全国家标准 酱油》的规定，酱油中菌落总数限量要求为≤3×104cfu/ml，但多数企业为了保障产品安全放行，将内控标准限定至远低于3×104 cfu/ml。小麦颗粒作为重要的粮食原料，其表面菌落总数同样是衡量原料卫生质量的关键指标。然而，目前传统菌落总数检测方法需依托专业实验室及专业人员操作，存在检测周期较长的问题；国内外虽已针对上述问题开发出多种菌落总数快速检测方法，但难以同时兼顾现场快速检测与高灵敏度要求，且面向酱油、小麦颗粒等复杂基质的菌落总数快速检测技术仍较为匮乏。因此，建立快速、准确、高灵敏的菌落总数快速检测方法对于酱油及小麦的质量控制具有重要意义。

2、目前，食品中菌落总数的检测主要采用gb 4789.2《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中规定的平板计数法。该方法的基本操作流程包括：样品稀释、倾注平皿、36℃±1℃培养48±2 h、计数报告。虽然平板计数法作为菌落总数检测的“金标准”具有结果准确、权威性高的优点，但其存在以下固有缺陷：

3、（一）检测周期过长。平板计数法需要48±2 h的培养时间，从样品采集到出具检测报告通常需要2～3天。对于食品生产企业而言，漫长的检测周期会导致产品无法及时售卖，带来较高的储存成本与储存污染风险。

4、（二）操作繁琐、需要专业的仪器设备与人员操作。传统平板计数法涉及的样品处理与样品检测流程，操作繁琐，且在操作过程中为避免环境污染，通常需要在配备有专业仪器的实验室中进行；不同操作人员带来的人为误差也会对检测结果的准确度与稳定性带来较大干扰。

5、（三）复杂食品基质对检测的干扰。对于基质复杂的样品，一般的快速检测方法具有较大的颜色与成分干扰；如，小麦颗粒的样品前处理方法与菌落总数检测方法目前缺乏相应标准，且小麦颗粒中的淀粉与蛋白含量较高，研磨后使用传统平板计数法进行菌落总数检测时，淀粉颗粒与菌落总数混合难以通过肉眼进行分辨。

6、为解决上述问题，近年来研究者们开发了多种菌落总数快速检测技术。如：仪器分析法、atp生物发光法及免疫学等技术。这些方法的基本操作流程包括：样品前处理、孵育或信号采集、仪器判读及结果输出。虽然快速检测方法作为平板计数法的补充手段具有检测时间短、操作简便及可实现现场筛查的优点，但仍存在以下不足：

7、（一）对“活菌”计数的准确性不足。目前多数快速检测方法（如atp生物发光法）无法有效区分活菌与死菌的代谢信号，其检测结果通常是基于总腺苷三磷酸（atp）含量进行推算，易受样品中游离atp及死菌残留atp的干扰，导致检测值偏高，从而造成对实际活菌总数的误判。当需要对样品进行重复检测时，还可能因为酶底物活性改变而导致信号衰减严重，使得检测的重复性和稳定性较差。

8、（二）灵敏度和抗基质干扰能力有限。现阶段，快速检测方法的检测限通常高于传统平板计数法，对于低浓度污染样品的检出能力不足，易出现假阴性结果。同时，食品基质成分复杂，如酱油中的色素、小麦颗粒中的淀粉与蛋白成分均可能抑制酶反应或干扰光电信号采集，导致检测结果误差较大。此外，部分快速检测方法对样品前处理要求较高，处理不当会进一步放大基质效应，无法有效反映样品的真实微生物污染状况，同时无法满足企业对产品的放行要求。

9、综上，开发一种操作简便、成本低廉、检测周期短、适用于复杂食品基质的菌落总数快速检测方法，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，解决现有菌落总数检测方法检测周期过长、操作繁琐、需要专业仪器设备与专业人员操作、对“活菌”计数的准确性不足以及灵敏度和抗基质干扰能力有限等问题。本发明提供了一种菌落总数快速检测方法，该方法通过“短时培养-信号增敏”双重扩增策略的有机耦合，利用各环节间的生化兼容性与信号传递链的协同增强效应，构建了“活菌代谢增殖→膜通透性调控→原位显色富集”的三联信号放大通路，从而在复杂基质中实现优异的综合检测性能，使整体检测限（100 cfu/ml）显著低于各独立技术单独应用时的理论下限，最终实现复杂基质样品中菌落总数的快速高灵敏检测。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种集成短时培养与信号增敏的菌落总数高灵敏快速检测方法，该方法包括如下步骤：

4、s1、样品前处理：灭菌处理后，在无菌条件下采用pbs缓冲溶液对食品样品进行稀释或表面洗脱，再加入lb液体培养基开展不大于6h的短时培养，使样品内目标活菌增殖至可检测水平，同时消除基质干扰；

5、s2、富集捕获：将前处理后的待测液滴加至侧向流试纸条的样品垫上，借助毛细作用实现细菌在反应垫上的原位富集固定；

6、s3、原位显色：将富集捕获后的侧向流试纸条放入含edta-2na的mtt显色液中，显色反应30 min以上，使edta-2na调控细菌外膜通透性，促进mtt进入活菌内部发生代谢显色反应；

7、s4、结果判读：通过目视比色半定量或灰度值分析定量，得到样品菌落总数。

8、本发明的检测方法中，前处理步骤使用了缓冲溶液及lb液体培养基，一方面通过适配稀释或振荡洗脱快速消除酱油色素、高盐及氨基酸背景，以及小麦颗粒表面淀粉和蛋白大分子等基质干扰；另一方面，通过在处理管内进行短时动态培养，使目标活菌在低起始浓度下快速增殖至可检测阈值。针对酱油和小麦颗粒，本发明分别优化出仅需6小时和1小时的最佳短时培养方法，与传统48小时培养法相比培养时间大幅缩短。

9、检测步骤采用了由玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水垫构成的侧向流试纸条，通过物理截留和表面吸附实现细菌的原位富集与固定，为后续显色反应提供均相固相界面。该试纸条同时集成了样品接收、预处理、靶标捕获及废液吸收功能，支持现场即时操作。

10、显色判读步骤引入含乙二胺四乙酸二钠（edta-2na）的mtt（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）显色液，其关键在于：edta-2na不仅可以螯合复杂样品中残留的金属离子抑制剂，更重要的是，其可以特异性地结合并移除细菌外膜上的ca²⁺和mg²⁺，释放脂多糖以提升外膜通透性，从而显著促进mtt进入活菌线粒体并与琥珀酸脱氢酶反应，生成不溶性蓝紫色甲臢产物。该增敏机制与前端短时培养形成“增殖－通透－显色”的正反馈联动：短时培养扩增获得了活菌绝对数量，edta-2na同步放大单个菌体的显色产率，二者协同放大颜色信号响应幅度，最终将酱油样品检测下限降低至100 cfu/ml（总时长7~8小时），小麦颗粒样品至1000 cfu/ml（总时长3~4小时）。

11、判读方式支持目视比色半定量与灰度值分析双重模式，无需外接大型仪器。

12、本发明方法有效解决了“活菌”计数准确性难题，通过短时增殖耦合代谢活性显色原理，仅对具有代谢活性的活菌产生信号累积，避免死菌或受损菌体带来的假阳性干扰，同时利用edta-2na对复杂基质中常见金属离子抑制剂的络合中和作用，显著增强抗基质干扰能力，确保在酱油高盐、高氨基酸及小麦颗粒高淀粉等复杂背景下仍保持稳定检测性能。

13、优选地，所述食品样品包括酱油和小麦颗粒。所述基于短时培养与信号增敏的高灵敏快速检测酱油和小麦颗粒菌落总数的方法在准确度、精密度、检测限、专属性和耐用性等方面性能良好，可满足食品生产企业过程监控与食品安全快速筛查的实际应用需求。

14、更优选地，针对酱油样品，短时培养时间为4-6 h；针对小麦颗粒样品，短时培养时间为＞0，≤1 h。

15、更优选地，酱油样品的检出限为100 cfu/ml（总检测时间控制在7-8 h内），小麦颗粒样品的检出限为1000 cfu/ml（总检测时间控制在3-4 h内）。

16、优选地，所述edta-2na在mtt显色液中的终浓度为8-10 mm。通过在显色液中加入的edta-2na实现对显色信号的增敏，edta-2na能特异性地结合并移除细菌外膜上的镁离子和钙离子从而释放细胞外膜上的脂多糖，从而增加细菌细胞膜的通透性，使得细菌显色液加速进入细胞并与细菌代谢产物反应产生可视化颜色信号。

17、优选地，所述显色反应的温度为室温至37 ℃。

18、优选地，步骤s4根据灰度值分析建立半定量判读区间：酱油样品灰度值＜3100对应菌落总数＜100 cfu/ml，灰度值3100～4000对应菌落总数100～1000 cfu/ml，灰度值＞4000对应菌落总数＞1000 cfu/ml；小麦颗粒样品灰度值＜1500对应菌落总数＜1000 cfu/ml，灰度值1500～3600对应菌落总数1000～10000 cfu/ml，灰度值＞3600对应菌落总数＞10000 cfu/ml。

19、优选地，所述侧向流试纸条由玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水垫组装而成，依靠物理截留与表面吸附作用实现细菌原位富集固定。所述试纸条集成有样品接收、样品预处理、靶标富集、信号收集与废液处理模块，所述试纸条可实现现场快速检测与即时结果输出。

20、更优选地，所述侧向流层析试纸条以pvc背板为支撑，上游为玻璃纤维膜制成的样品垫，中部为硝酸纤维素膜构成的反应垫，下游为吸水垫；样品垫与反应垫、反应垫与吸水垫之间相互搭接，利用毛细作用驱动液体迁移。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、本发明公开了一种集成短时培养与信号增敏技术的高灵敏快速检测菌落总数的方法，该方法包括基于缓冲溶液及lb液体培养基的样品前处理、侧向流试纸条富集捕获、edta-2na-mtt原位显色与结果判读步骤，该方法耦合短时培养与信号增敏构建三联信号放大通路，利用活菌增殖与细菌外膜通透性调控协同放大显色信号。该方法可以显著缩短检测周期，总检测时长远优于传统48 h平板计数法；同时，基于活菌代谢显色原理，该方法仅对活性活菌产生响应，可以有效减少假阳性干扰。此外，前处理可有效消除食品样品中色素、高盐、淀粉及蛋白等基质干扰，检出限可低至100 cfu/ml，无需大型仪器，支持目视与灰度值双重判读，检测准确度、精密度及抗干扰性能优异，适用于各类复杂食品基质的现场快速检测。