DNA打印方法和组合物与流程

本公开涉及一种用于在用于测定(例如微阵列)的基板上打印生物材料(例如dsdna)的组合物。

背景技术：

1、微阵列是生物材料(例如蛋白质、dna、抗原或抗体、脂质或肽)的二维阵列，其沉积并固定在通常由功能化玻璃或塑料制成的固体且通常平坦的基板上。通常选择基板以提供与生物材料的充分的结合，但也避免所述材料的任何改性，例如在蛋白质的变性。

2、通常，一旦生物材料微阵列已经沉积在基板上，就将封闭缓冲液施加到微阵列表面以防止不需要的材料结合到基板表面。然后，微阵列与样品反应，并通过合适的微阵列分析技术(例如暗场显微镜)执行检测。用于血型检定和供体疾病筛查的这样的基于微阵列的技术的示例是alivedx的mosaiqtm。

3、生物材料的沉积通常通过打印进行，例如使用系统，例如mosaiqtm制造系统(mms)、arrayjet的喷墨微阵列技术或scienion的sciflexarrayer。然而，打印需要打印溶液具有在可工作范围内的粘度，通常动态粘度为至少1mpa.s，例如至少2mpa.s，和/或约1-20mpa.s，例如约1-10mpa.s，例如约2-9mpa.s，例如约4-9mpa.s，例如约6-9mpa.s。为此，打印组合物中通常包含粘度调节剂。然而，应当理解，给定的打印溶液的最佳粘度可取决于所使用的打印设备的类型。

4、为了确保沉积的生物材料在打印时固定化在基板上，期望生物材料与基板相互作用，例如结合至基板。影响生物材料与基板结合的因素包括：

5、-生物材料的类型；

6、-基板的类型；

7、-ph；

8、-离子强度；

9、-粘度。

10、生物材料组合物的ph通常使用缓冲剂(例如磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液)控制。通常可以在组合物中以约5-300mm的浓度提供缓冲剂。

11、生物材料组合物的离子强度通常使用盐(例如nacl)控制。通常可以以约0至5m之间的浓度提供盐。典型的盐浓度可以为约150mm，因为这可对应于细胞质的重量摩尔渗透压浓度。

12、生物材料组合物的粘度通常使用粘度调节剂(例如蔗糖、海藻糖或甘油)控制。特别地，蛋白质分子的打印通常需要粘度调节剂的存在，以避免沉积在基板上的液体材料的快速干燥，这可能对蛋白质完整性具有负面影响。取决于增粘剂的类型，通常可以以约30-60%w/v或w/w的浓度提供所述粘度调节剂。

13、典型的基板具有包括与生物材料反应(例如共价反应)的反应性基团的涂层，以促进结合。这样的基板的示例是涂覆有含环氧材料(例如环氧基硅烷材料)的基板，例如玻璃。这样的基板通常称为“环氧玻璃”。这些基板的优点是涂层中的环氧基团可以与通常存在于许多生物材料中的多个化学基团(例如氨基(仲胺)、羟基或巯基部分)通常共价地反应，从而能够在打印时实现固定化。例如，蛋白质来源的分子能够通过带正电荷的氨基酸，例如精氨酸、组氨酸或赖氨酸与环氧基团结合。

14、然而，某些生物材料不包括能够与涂层中的反应性基团(例如环氧基)反应的游离反应性部分，或者具有其反应性因生物材料的构象而被减弱或抑制的反应性部分。例如，双链dna(dsdna)在其螺旋结构的表面上仅显示磷酸负电荷，这倾向于限制与涂层中的环氧基团的潜在共价结合。

15、us2004/0054160a1(pal)公开了含有核酸的介质或油墨溶液，其含有按照体积计30-80％的有机溶液，所述有机溶液包含dmso、乙二醇、甲酰胺或其组合。

16、deng等人(viscosity effects on micro bubble actuator in ssdnasolutions, micro electro mechanical systems, 2004)公开了通过在单链dna(ssdna)溶液中添加蔗糖以改变其粘度，研究了粘度在脉冲加热下对微气泡致动器的动态行为的影响。

17、wo02/059372a2(fagnani等人)公开了一种在固体基板的表面上由光学透明的水凝胶细胞形成的生物芯片。

18、本发明的目的是消除和/或缓解与现有技术和/或常规方法和系统相关联的限制和/或缺点。

19、本发明的目的是提供一种促进生物材料(例如dna材料如dsdna)在基板(例如功能化玻璃)上的固定化的打印组合物，例如打印缓冲液。

技术实现思路

1、如上所述，沉积的生物材料和基板之间的结合取决于许多因素，包括例如生物材料的类型、基板的类型、ph、离子强度和粘度。此外，粘度还影响包含待被打印的生物材料的组合物的可打印性。

2、本发明基于令人惊讶的发现，即通过将打印组合物中粘度调节剂的浓度降低到低于打印缓冲液中通常使用的浓度水平，可以显著改善dna材料(例如dsdna)和基板(例如功能化基板，例如环氧玻璃)之间的结合。这是令人惊讶的，因为如上所述，粘度调节剂被认为是获得打印组合物中足以进行打印的粘度所必需的。不希望受理论束缚，据信dna材料(例如dsdna)的大分子性质允许组合物保持可打印，尽管组合物中的增粘剂浓度比常规样品低得多。

3、根据第一方面，提供了一种用于在用于测定的基板上打印生物材料的组合物，所述组合物包含：

4、生物材料；和

5、粘度调节剂，其中所述粘度调节剂在组合物中的浓度小于约30wt%。

6、粘度调节剂在组合物中的浓度可以高达约25wt%，例如高达约20wt%，例如高达约15wt%，例如高达约10wt%，例如高达约5wt%，例如高达约9wt%，例如高达约8wt%。

7、粘度调节剂在组合物中的浓度可以在约0.1-25wt%的范围内，例如0.1-20wt%，例如0.1-15wt%，例如0.1-10wt%，例如0.1-5wt%。通常，粘度调节剂在组合物中的浓度可以在约0.1-10wt%的范围内，例如约1-8wt%，例如约1-7.5wt%，例如约2.5-7.5wt%。

8、粘度调节剂可以包含碳水化合物，例如单糖、二糖或寡糖。通常，粘度调节剂可以包含二糖，例如选自由蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和几丁二糖组成的列表中的一种或更多种化合物。在一个实施方案中，粘度调节剂可以包含或可以由蔗糖和/或海藻糖组成。

9、粘度调节剂可以包含多元醇，例如甘油。

10、增粘剂在组合物中的重量浓度可以表示为%w/v或%w/w。例如，当粘度调节剂包含碳水化合物(例如蔗糖或海藻糖)时，浓度可以以%w/w或%w/v计。当粘度调节剂包含多元醇(例如甘油)时，浓度通常可以以%w/v计。

11、在一个实施方案中，粘度调节剂可以包含碳水化合物，例如二糖，如蔗糖或海藻糖。

12、通常，粘度调节剂的重量百分比可以表示为w/v。

13、粘度调节剂(例如二糖)的浓度可以高达约10%w/v，例如高达约9%w/v，高达约8%w/v，例如高达约7%w/v，例如高达约6%w/v，例如高达约5%w/v，例如高达约4%w/v，例如高达约3%w/v，例如高达约2%w/v，例如高达约1%w/v，例如高达约0.1%w/v，例如高达约0.01%w/v。粘度调节剂的浓度可以在约0.01-9%w/v的范围内，例如约0.01-8%w/v，例如约0.1-8%w/v，例如约1-7.5%w/v，例如约1-5%w/v。

14、将理解的是，w/v浓度能够转换为w/w浓度，反之亦然。例如，对于蔗糖，转换如下表1所示。

15、表1：蔗糖水溶液的w/w至w/v转换

16、

17、所述组合物可以包含缓冲剂，例如磷酸盐、碳酸盐或乙酸盐缓冲液。通常可以在组合物中以约5-300mm，例如约10-250mm，例如约20-200mm的浓度提供缓冲剂。

18、所述组合物可以包含盐，通常为无机盐。通过这样的提供，所述盐可以影响组合物的离子强度，但是可以与生物材料具有有限的反应性或不具有反应性。通常，所述盐可以包含选自由氯化钠(nacl)、氯化钙(cacl2)、氯化镁(mgcl2)、碳酸氢钠(nahco3)、氯化钾(kcl)、硫酸钠(na2so4)、碳酸钙(caco3)和磷酸钙(ca3(po4)2)组成的列表中的一种或更多种化合物。方便地，后者可以包含nacl或可以由nacl组成。

19、所述盐通常可以以约0至5m之间的浓度提供，例如约0.025m至4m之间，例如约0.1至4m之间，例如约0.5至4m之间，例如约1至2m之间。例如，当生物材料包含dna材料时，通常可以在组合物中以约1至4m之间，例如约1.5至2m之间的浓度提供所述盐。令人惊讶地发现，通过提高打印组合物中盐的浓度，例如高于约0.5、1或1.5m，可以显著改善dna材料(例如dsdna)和基板(例如功能化基板，例如环氧玻璃)之间的结合。

20、所述组合物可以包含载体或溶剂，通常是水，例如蒸馏水、去离子水等。

21、所述组合物包含生物材料。术语“生物材料”在本文中将被理解为涵盖任何生物材料，无论是天然的还是合成制备的。

22、通常，所述生物材料可以包含肽、蛋白质(包括重组蛋白)、氨基酸、核酸(dna和/或rna)、寡核苷酸、脂质、碳水化合物、酶、代谢物、抗体(包括单克隆抗体和/或多克隆抗体及其任何(抗原结合)片段)、抗原、细胞、红细胞、血浆、血清等。

23、所述生物材料可以包含含有dna的材料。

24、所述含有dna的材料可以包含dna材料或可以由dna材料组成，其可以任选地进一步包含非dna材料，例如蛋白质等。所述含有dna的材料可以包含dna复合物或可以由dna复合物组成。

25、生物材料可以包含染色质或可以由染色质组成。

26、生物材料可以包含dna材料或可以由dna材料组成。

27、生物材料可以包含dsdna或可以由dsdna组成。所述生物材料可以包含质粒dsdna和/或线性dsdna或可以由质粒dsdna和/或线性dsdna组成。有利地，令人惊讶地发现，当生物材料包含或为dna材料(例如dsdna或染色质)时，尽管粘度调节剂的浓度比在常规打印缓冲液中低得多，特别是在某些类型的打印设备(例如mms)中，dna材料与基板之间的结合可以得以实现和/或改善。不希望受理论束缚，据信该效果可能是由于dna相对于粘度的非牛顿特性。

28、通常，所述基板可由玻璃、硅或聚合物(例如硝化纤维)制成。

29、基板可以任选地涂覆有涂层，所述涂层可被选择以改善或改变生物材料的性质或与生物材料的相互作用，包含粘附、固定化、稳定等。所述涂层可包含、可基本上由或可由金属(例如铝或金)，或聚合物(例如亲水性聚合物或亲水性聚合物，如聚丙烯酰胺、环氧硅烷等)组成。

30、优选地，所述基板可以包含或可以是涂覆有含环氧材料(例如环氧基硅烷材料)的玻璃。这种类型的基板可以被称为“环氧玻璃”。

31、所述基板可以被称为“芯片”。

32、测定可以包含或可以是微阵列。

33、通常，固定化到基板表面的生物材料的离散量(例如点)的尺寸(例如直径)可以为约100μm-300μm，例如约150μm-250μm，通常约210μm＋/－40μm。

34、根据第二方面，提供了一种用于在用于测定的基板上打印生物材料的方法，所述方法包括：

35、提供组合物，所述组合物包含

36、生物材料；和

37、粘度调节剂，其中所述粘度调节剂在组合物中的浓度小于约30wt%；和

38、将所述组合物打印在基板上。

39、与第一方面中描述的组合物相关的特征可以同样适用于此，并且不再重复，仅为了简洁起见。

40、通常，所述基板可以包含或可以是涂覆有含环氧材料(例如环氧基硅烷材料)的玻璃。这种类型的基板可以被称为“环氧玻璃”。

41、所述方法可包含干燥组合物。

42、所述方法可包含在基板上(例如在其表面上)的一个或更多个离散位置处打印组合物。

43、所述方法可包含在定义阵列(例如微阵列)的一个或更多个离散位置处打印组合物。

44、所述阵列可以是或可以限定一维、二维或三维阵列。通常，所述阵列可以是或可以在其表面上限定二维阵列。

45、通常，基板的表面，例如在其上打印和/或固定化组合物的表面，是平坦的或平面的或基本上平坦的或平面的。术语“平坦的”和“平面的”将被理解为是指宏观水平的表面的形状，即，在本文中被理解为指表面不包括可被配置为接收物质或组合物的任何孔或沟槽。相反，在原本基本上连续的表面的基板上的不同和/或离散位置处打印和/或固定化物质或组合物。基板的至少一部分，例如被配置为接收组合物或其他物质的基板的表面的一部分，可以没有孔或凹槽。

46、所述方法可进一步包含封闭在基板上打印的材料，例如封闭所述组合物的生物材料，和/或在基板上打印和/或固定化的任何其他物质。

47、所述方法可以包含将封闭组合物喷洒到基板的至少一部分上，例如喷洒在生物材料上。

48、封闭组合物可包含封闭缓冲液、可由封闭缓冲液组成或可基本上由封闭缓冲液组成。

49、根据第三方面，提供了组合物用于在用于测定的基板上打印的用途，

50、其中所述组合物包含：

51、生物材料；和

52、粘度调节剂，其中所述粘度调节剂在组合物中的浓度小于约30wt%。

53、与第一方面中描述的组合物相关的特征可以同样适用于此，并且不再重复，仅为了简洁起见。

54、生物材料可以包含含有dna的材料，例如dsdna和/或染色质。

55、粘度调节剂可以包含碳水化合物，例如二糖，如蔗糖或海藻糖。

56、所述基板可以包含或可以是涂覆有含环氧材料(例如环氧基硅烷材料)的玻璃。这种类型的基板可以被称为“环氧玻璃”。

57、为了避免疑义，关于本发明的任何方面描述的任何特征可以以任何适当的组合应用于本发明的任何其他方面。例如，方法或使用特征可以应用于组合物特征，反之亦然。