一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法及其应用与流程

本发明属于生物，涉及一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法及其应用。

背景技术：

1、脐带血中含有丰富的血小板，其内蕴含多种生长因子和蛋白质，可诱导、调节细胞分裂、分化及增殖，加速组织的自然愈合过程，还具有抑菌、减轻疼痛等多种作用。当身体出现伤口时，血小板开始发挥自身的凝血功能使伤口快速止血，同时被激活后会释放出众多生长因子，促使自体组织再生修复。因此，脐带血已成为富血小板血浆（prp）的重要来源，是一种非常重要的人类生物资源。

2、与自体富血小板血浆（a-prp）相比，脐带血富血小板血浆（cb-prp）具有鲜明的特性与优势。a-prp取自患者自身血液，其质量直接受患者健康状况影响，因此可能不适用于部分患者。而cb-prp来源于新生儿出生时采集的脐带血，经过严格筛选与检测，确保安全性与品质稳定，可依据每位患者的个体情况进行针对性应用。

3、目前，prp的采集技术大多数只用于外周血，虽然也同样可以用于脐带血的prp采集，但针对性不强。由于脐带血中细胞的种类和数量与外周血有所不同，脐带血不仅含有正常血液的红细胞、白细胞、血小板、血清等所有成分，还含有大量造血干细胞、间充质干细胞、nk细胞、t细胞。因此，从脐带血中采集prp不能照搬用于外周血的方法。目前脐带血中采集cb-prp的方法基本都来源于外周血的采集方法，回收率较低，会造成脐带血资源的浪费。

4、因此，开发一种专门针对脐带血、能够显著提高血小板回收率的方法，具有重要的临床应用价值和经济意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法及其应用，解决了现有脐带血富血小板血浆采集方法回收率低、针对性不强的技术问题。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法包括：将脐带血和抗凝剂进行混合均质，得到混合溶液；将所述混合溶液进行第一次离心，收集上层血浆及血小板层，置于第一收集容器中；向第一次离心后剩余的血液中加入氯化钠溶液进行定容，定容后进行第二次离心，收集上层血浆和生理盐水层，置于第二收集容器中；所述第一收集容器和所述第二收集容器中的液体分别进行第三次离心；弃去所述第二收集容器中的上清液，使用所述第一收集容器中的上清液对所述第一收集容器和所述第二收集容器中的沉淀进行重悬，得到脐带血富血小板血浆。

4、本发明通过在离心前加入抗凝剂（优选枸橼酸钠）防止血小板被激活凝固，通过三次离心（优选第一次离心力600~1000 g、离心时间5~10 min，第二次离心力600~1000 g、离心时间5~10 min，第三次离心力1500~3000 g、离心时间15~30 min），并在第二次离心前采用质量百分含量为0.85%~0.95%的氯化钠溶液对剩余血液进行定容，以及第三次离心后使用第一收集容器中的上清液对两个容器中的沉淀进行重悬，显著提高了脐带血中血小板的回收率，回收率可达78%，具有操作简便、回收率高、成本低廉等优点，适用于临床推广和工业化应用。

5、优选地，所述脐带血和抗凝剂的体积比为(100~150): (25~30)，例如100 ml:28ml、120 ml:28 ml或150 ml:28 ml。

6、优选地，所述氯化钠溶液中氯化钠的质量百分含量为0.85%~0.95%，例如0.85%，0.90%或0.95%。

7、优选地，所述抗凝剂包括枸橼酸钠。

8、优选地，所述第一次离心的离心力为600~1000 g（例如600 g、800 g或1000 g），离心时间为5~10 min（例如5 min、8 min或10 min）。

9、优选地，所述第二次离心的离心力为600~1000 g（例如600 g、800 g或1000 g），离心时间为5~10 min（例如5 min、8 min或10 min）。

10、优选地，所述第三次离心的离心力为1500~3000 g（例如2000 g、2500 g或3000g），离心时间为15~30 min（例如15 min、20 min或30 min）。

11、作为一种优选的技术方案，本发明提供一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，所述方法包括以下步骤：

12、（1）将脐带血和抗凝剂按照体积比为(100~150):(25~30)进行混合均质，得到混合溶液，将所述混合溶液进行离心力为600~1000 g、离心时间为5~10 min的第一次离心，吸取第一次离心后得到的上层血浆及血小板层，收集至第一收集容器中；所述抗凝剂包括枸橼酸钠；

13、（2）向剩余血液中加入质量百分含量为0.85%~0.95%的氯化钠溶液进行定容，定容后进行离心力为600~1000 g、离心时间为5~10 min的第二次离心，吸取第二次离心后得到的上层血浆和生理盐水层，收集至第二收集容器中；

14、（3）所述第一收集容器和所述第二收集容器中的液体分别进行离心力为1500~3000 g、离心时间为15~30 min的第三次离心；

15、（4）弃去所述第二收集容器中的上清液，使用所述第一收集容器中的上清液对所述第一收集容器和所述第二收集容器中的沉淀进行重悬，得到脐带血富血小板血浆。

16、第二方面，本发明提供一种第一方面所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的应用。

17、第三方面，本发明提供一种第一方面所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法在制备用于治疗子宫内膜损伤或腺肌症的细胞治疗制剂中的应用。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、（1）本发明通过在离心前加入抗凝剂（枸橼酸钠），有效防止血小板被激活导致凝固，提高了血小板的活性和回收率；

20、（2）本发明在第二次离心前采用浓度为0.85%~0.95%的氯化钠溶液对剩余血液进行定容，替代了传统的葡萄糖溶液，分层更明显，血小板收集更充分；

21、（3）本发明采用优化的三次离心参数，相比于现有技术，显著提高了血小板的回收率；

22、（4）本发明在第三次离心后，弃去第二收集容器中的上清液，使用第一收集容器中的上清液对两个容器中的沉淀进行重悬，有效保留了血小板，进一步提高了回收率，采用本发明方法，血小板回收率可达78%，显著高于对照组，具有显著的进步；

23、（5）本发明方法操作简便、成本低廉、适用于临床推广和工业化应用。

1.一种提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法包括：将脐带血和抗凝剂进行混合均质，得到混合溶液；将所述混合溶液进行第一次离心，收集上层血浆及血小板层，置于第一收集容器中；向第一次离心后剩余的血液中加入氯化钠溶液进行定容，定容后进行第二次离心，收集上层血浆和生理盐水层，置于第二收集容器中；所述第一收集容器和所述第二收集容器中的液体分别进行第三次离心；弃去所述第二收集容器中的上清液，使用所述第一收集容器中的上清液对所述第一收集容器和所述第二收集容器中的沉淀进行重悬，得到脐带血富血小板血浆。

2.根据权利要求1所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述脐带血和抗凝剂的体积比为(100~150): (25~30)。

3.根据权利要求1或2所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述氯化钠溶液中氯化钠的质量百分含量为0.85%~0.95%。

4.根据权利要求1-3中任一项所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述抗凝剂包括枸橼酸钠。

5.根据权利要求1-4中任一项所述提高脐带血富血小板血浆采集率的方法，其特征在于，所述第一次离心的离心力为600~1000 g，离心时间为5~10 min。

6.根据权利要求1-5中任一项所述提高脐带血富血小板血浆采集率的方法，其特征在于，所述第二次离心的离心力为600~1000 g，离心时间为5~10 min。

7.根据权利要求1-6中任一项所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述第三次离心的离心力为1500~3000 g，离心时间为15~30 min。

8.根据权利要求1-7中任一项所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法，其特征在于，所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法包括以下步骤：

9.权利要求1-8中任一项所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的应用。

10.权利要求1-8中任一项所述提高脐带血富血小板血浆回收率的方法在制备用于治疗子宫内膜损伤或腺肌症的细胞治疗制剂中的应用。