一种通过小分子抑制剂FK228浸泡阻碍鲤PGC发育的方法

本发明属于水产动物遗传育种，具体涉及一种通过小分子抑制剂fk228浸泡阻碍鲤pgc发育的方法。

背景技术：

1、对于有性生殖动物而言，生命起始于精卵结合形成的受精卵，而精子和卵子均来源于同一种前体细胞，即原始生殖细胞（primordial germ cells, pgcs）（pamula andlehmann, 2024）。作为生殖细胞的祖细胞，pgc是鱼类生殖发育的基础。鱼类pgc在胚胎早期特化形成后，经过长距离的迁移到达性腺原基的位置，之后与周围的体细胞相互作用形成性腺（tanaka et al., 2008; xu et al., 2010; dranow et al., 2013; nishimura andtanaka, 2014）。鱼类pgc发育调控是养殖鱼类育性控制技术开发的重要基础（xu et al.,2022）。

2、鲤的育性控制具有多重潜在应用价值。hu等人通过转反义gnrh初步探索了鲤的育性控制，约有31%的转反义gnrh鲤性腺败育，该研究主要是为了防范转基因鲤逃逸后与野生鲤群体交配，影响野生鲤种群的基因库（hu et al., 2007）。但不育鲤的研究意义不止如此，随着基因编辑技术在鲤等养殖鱼类育种中的广泛应用（zhong et al., 2016; blix etal., 2021; zhai et al., 2021），亟需通过不育技术打消公众对基因编辑鲤的潜在生态风险的担忧；而且，不育还是保护优质鱼类种苗知识产权、促进种业健康有序发展的有效手段（xu et al., 2022）。

3、鱼类育性控制的一种有效策略是对pgc进行操作，胚胎阶段剔除pgc可实现成鱼的完全不育（wargelius et al., 2016; kleppe et al., 2017）。申请人前期发现dead end是调控鲤pgc发育的重要因子（tao et al., 2021），这是目前关于鲤pgc发育调控仅有的公开报道。

4、组蛋白去乙酰化酶（hdacs）是能够催化移除核心组蛋白及其他蛋白质上的乙酰基团的酶（seto and yoshida, 2014）。组蛋白上的乙酰基被去除后会导致染色质开放程度改变从而调控基因的表达（dovey et al., 2010a）。fk228（romidepsin）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可特异性抑制hdac1/2的酶活性（zhao et al., 2019; dang et al., 2022）。尚无通过fk228处理调控动物pgc发育的相关研究报道，

5、目前已报道在胚胎期通过浸泡法导致pgc发育障碍的方法主要有以下两种：（1）斑马鱼等鱼类胚胎短期浸泡dead end-mo-vivo可以实现生殖细胞的减少或剔除，这种方法的实质是对pgc发育的保守基因dead end进行敲降（wong and zohar, 2015; yanagitsuruet al., 2025）。（2）斑马鱼胚胎期浸泡名为primordazine的小分子化合物，可以显著减少斑马鱼胚胎性腺原基处的pgc。primordazine通过dead end和nanos3等基因3' utrs中应答元件，实现pgc发育相关基因的翻译抑制（jin et al., 2018）。然而，上述方法中使用的小分子化合物获取困难且费用高，限制了其在养殖鱼类规模化应用中的推广。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种通过小分子抑制剂fk228浸泡阻碍鲤pgc发育的方法，解决了现有技术中的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种通过小分子抑制剂fk228浸泡阻碍鲤pgc发育的方法，包括以下步骤：

4、对鲤胚胎进行去卵膜处理；

5、将去卵膜后的所述鲤胚胎置于缓冲液中进行培养；

6、当所述鲤胚胎发育至囊胚隆起期，将所述鲤胚胎转移至含有500 nm小分子抑制剂fk228的缓冲液中进行持续浸泡处理，并维持至所述鲤胚胎发育至prim-22期。

7、进一步地，所述缓冲液的组分包括：17.4 mm nacl、0.21 mm kcl、0.12 mm mgso4、0.18 mm ca(no3)2以及1.5 mm hepes。

8、进一步地，所述去卵膜处理的过程包括：

9、使用终浓度为1 g/l且溶于缓冲液的胰蛋白酶工作液，处理刚完成人工授精的鲤胚胎；

10、在卵膜完全消化后，将所述鲤胚胎转移至铺有琼脂且装有缓冲液的培养皿中连续漂洗。

11、进一步地，配置含有500 nm小分子抑制剂fk228的缓冲液的过程包括：

12、将所述小分子抑制剂fk228溶于二甲基亚砜中，配制成10 mm的母液

13、使用所述缓冲液将所述母液进行稀释。

14、进一步地，在所述培养以及所述持续浸泡处理的过程中，控制胚胎密度为每毫升培养液中包含6枚所述鲤胚胎。

15、进一步地，在所述持续浸泡处理的过程中，每间隔12小时更换一次所述含有500nm小分子抑制剂fk228的缓冲液

16、小分子抑制剂fk228在制备阻碍鲤原始生殖细胞发育的试剂中的应用，所述试剂被配置为自去卵膜鲤胚胎发育至囊胚隆起期开始对其进行持续浸泡处理，并维持至prim-22期。

17、进一步地，所述试剂中包含的小分子抑制剂fk228的工作浓度被配置为500 nm。

18、进一步地，试剂的溶液载体为缓冲液，所述缓冲液的组分包括：17.4 mm nacl、0.21 mm kcl、0.12 mm mgso4、0.18 mm ca(no3)2以及1.5 mm hepes。

19、一种化合物在制备鲤育性控制的试剂中的应用，所述化合物为小分子抑制剂fk228，所述试剂包含浓度为500 nm的fk228；

20、所述试剂被配置为自去卵膜鲤胚胎发育至囊胚隆起期开始进行持续浸泡处理，并维持至prim-22期。

21、本发明的有益效果：

22、1、本发明选用组蛋白去乙酰化酶抑制剂 fk228 替代了上述昂贵的靶向化合物，开辟了通过组蛋白乙酰化调控途径实现鱼类 pgc 缺失的新思路。该方案无需依赖显微注射等特殊仪器设备，仅通过将去卵膜胚胎置于含有该小分子的缓冲液中进行简单浸泡处理即可生效。这种化繁为简的操作流程赋予了该方法高通量的处理能力，切实解决了现有技术难以低成本、大规模应用的问题，为保护优质鱼类种苗知识产权和防范基因编辑鱼类生态风险提供了更具落地可行性的技术工具。

23、2、本发明通过严格的浓度梯度对比（如设置 500 nm 与 1 μm 组别）确立了安全操作基准。数据表明，选用 500 nm 浓度的 fk228 浸泡液，能够保障鲤胚胎保持正常的发育进程，且未见处理胚胎发生形体畸变；而当浓度提升至 1 μm 时，则会导致胚胎的致死率和畸形率显著上升。通过这种特定浓度的精准界定，在有效作用于目标细胞的同时，充分保障了养殖鱼苗的基础存活率与健康度。

24、3、本发明将干预的时机精准锁定在胚胎发育至囊胚隆起期（dome stage，此时pgc已特化形成），并维持处理至 prim-22 期。结合实施例2与实施例3的荧光染色统计结果，在该特定时间窗口内持续给予 fk228 浸泡，产生了双重干预效果：一方面，处理组 prim-22期的 pgc 总数较对照组显著下降；另一方面，导致未迁移至生殖嵴的紊乱 pgc 数量显著上升。这种将源头数量削减与后期迁移轨迹干扰相结合的机制，显著提升了阻碍生殖细胞发育的可靠性。