用于连接的衔接子的制作方法

本发明涉及寡核苷酸与dna片段的连接领域。本发明的连接方法可以用于将包含例如衔接子、引物结合位点、启动子、标签、条形码或前述任何组合的寡核苷酸附接至dna片段。

背景技术：

1、染色质免疫沉淀（chip）与下一代测序（chip-seq）联用，用于绘制染色质因子和组蛋白修饰的基因组占据情况。为实现高通量处理能力并减少样品间的技术变异，最近出现了通过免疫沉淀前样品混池进行的多重chip-seq。多重化只有在以下情况下才是可能的：各个样品首先以衔接子形式的独特dna序列被加上条形码，然后才与其他样品合并。然而，衔接子连接至核小体或其他蛋白质结合的dna片段通常遭受低效率，并且因此经常通过过量的衔接子分子来规避。由于衔接子（约60bp）、转录因子结合的dna（约50bp）和核小体dna（约150 bp）之间的尺寸差异很小，过量的游离衔接子无法通过常规的基于磁珠或柱的尺寸选择纯化方法有效去除。当在高浓度下连接衔接子时形成的衔接子二聚体或串联体也非常难以去除。这些无效的衔接子形式不可避免地会通过chip工作流程被携带，并污染后续的测序。由于其尺寸小且拷贝数相对较高，衔接子污染会严重消耗测序试剂，从而显著降低每次测序运行中可用的读段数量。

技术实现思路

1、因此，存在对以下衔接子的未满足需求：衔接子能够以增强的效率连接或以其他方式附接至dna片段，并且特别是蛋白质结合的dna片段，并且同时允许区分游离衔接子或衔接子二聚体与附接至所述dna的衔接子。

2、特别是，存在对重新设计的样品条形码衔接子的未满足需求，以允许增强的连接。

3、本专利申请描述了一种核苷酸条形码衔接子的新颖设计，该衔接子在其未连接的游离形式下，在连接衔接子被扩增的条件下不被扩增。本文中，此类衔接子被称为“补平衔接子”。具体地，本发明的补平衔接子的衔接子功能仅在它们与其他dna片段（如基因组dna片段或细胞游离dna）连接时才得以恢复。通过减轻衔接子污染，本发明的补平衔接子不仅具有成本效益（例如，当用于下一代测序时），而且由于对期望连接产物的更具选择性扩增，它们还促进了更高的文库多样性。此外，由于单体衔接子本身是无功能的，其允许采用更激进的尺寸选择方案以保留小dna片段。例如，这对于使用chip以高分辨率绘制转录因子足迹是有利的。

4、本发明提供了以如下方式设计的衔接子：通过选择性扩增，可以将游离衔接子或衔接子二聚体与附接于dna片段的衔接子区分开。

5、特别地，在涉及将补平衔接子连接至染色质片段的本发明实施方案中，补平衔接子的设计使得在选择性扩增期间，只有连接至靶染色质片段的衔接子可以被携带。靶染色质片段通常被广泛定义为转录因子结合的，其通常为约50 bp或核小体的，其通常为约150bp。染色质片段可以是例如制备的细胞染色质，或者它们可以是细胞游离染色质。本文中衔接子与靶dna的连接也称为有效连接，与衔接子的自连接相对。

6、更具体地，本发明的这些衔接子包含单链扩增序列和切口位点。单链扩增序列位于衔接子的一端，并且仅在双链dna的形式中，即在合成互补链后，才作为扩增起始位点发挥功能。在互补链内，切口位点位于靠近衔接子的另一端。如果衔接子在切口形成后于升高的温度下孵育，则切口位点与衔接子末端之间的所得短寡核苷酸链将从衔接子解离。类似地，如果形成衔接子二聚体，则它们在切口形成后于升高的温度下孵育时将会解离。

7、相比之下，连接至dna片段（如染色质片段的gdna部分）的衔接子将不会解离。链置换聚合酶将能够延伸被切口的链，并且从而合成扩增起始位点的互补链。

8、本发明的概念在图1a至图1e和图2中说明。图1b至图1e示出了本发明的补平衔接子的具体实例，而图2说明了其原理。根据本发明的补平衔接子由2条链组成。上链由表示为a、b和c的3个区域组成，而下链由表示为a’、b’和c’的3个区域组成。a包含单链区域（a1），并且当与其互补序列结合时，其构成启动子，或者其是引物结合位点的互补序列。a1’与a1基本上非互补。重要的是，a被设计成使得仅当a与其互补序列退火时，补平衔接子的转录才能发生。a’对外切核酸酶具有抗性。c’或-b’-c’包含切口内切核酸酶识别位点或预识别位点。所述识别位点包含以下或由以下组成：切口位点，即所述内切核酸酶使衔接子产生切口的位点。在一些实施方案中，该切口内切核酸酶识别位点由单个核苷酸（例如du）组成，并且在此类实施方案中，该识别位点由切口位点组成。通常，切口位点位于c’片段的3’末端。a1与a1’之间的错配因此产生了一种叉形dna结构，该结构对dna连接具有抗性。更重要的是，此类单链a无法驱动/引发转录。补平衔接子的另一个关键特征是存在切口内切核酸酶识别位点，其可以是任何切口内切核酸酶识别位点。可替代地，其可以是预识别位点，其可以通过例如dna糖基化酶的作用转化为切口内切核酸酶识别位点。在切口位点处切口后可能产生3'羟基基团，从而允许通过链置换聚合酶进行后续引物延伸，该聚合酶合成新的下链并最终重建a的启动子或引物结合功能性。切口后，下链上产生的“引物”由于其短长度而变得非常不稳定，尤其是在热挑战下。然而，一旦衔接子连接到另一个dna片段，下链引物长度并且因此及其解链温度就会急剧增加。

9、因此，下链引物的长度以及由此产生的热稳定性提供了有效的选择基础，以在有效连接产物的情况下特异性重构a启动子/引物结合位点，而游离衔接子单体保持无活性。

10、衔接子二聚体可能存在另一个挑战。由于补平衔接子尾端的叉状结构，其不支持连接，并且因为a1’是耐外切核酸酶的，所以其对常规末端修复酶具有抗性。因此，衔接子二聚体只能以头对头构型存在，如图2中所说明。在这种情况下，rnase可以在上链和下链两者处产生切口，基本上将衔接子二聚体切割成单体形式。如果经受热挑战，衔接子二聚体将解离成单体形式。这也在图2中说明。

11、本发明概念的一个实例展示在图1c中。该实例的补平衔接子由以下组成：t7启动子、允许在illumina平台上测序的部分sbs引物结合位点、随机的8核苷酸唯一分子标识符（umi）以及随后的8核苷酸样品特异性条形码。该t7启动子用于任何下游dna片段的体外转录（ivt）。t7启动子的上链默认设计为大部分单链，而下链被一段由七个连续胞嘧啶通过耐外切核酸酶的硫代磷酸酯键相互连接所取代。因此，该错配产生了一种叉形dna结构，该结构对dna连接具有抗性。更重要的是，此类单链t7启动子无法由t7 rna聚合酶驱动ivt。本实例中补平衔接子的另一个关键特征是，样品条形码内的第八个核苷酸（从衔接子的连接端开始计数）是脱氧尿苷。在dna双链体中嵌入单个脱氧尿苷实质上创建了dna糖基化酶的识别位点。dna糖基化酶移除含氮碱基，同时保持糖磷酸骨架完整。这产生无嘌呤/无嘧啶位点（即ap位点），或者换句话说，无碱基位点。如本文所用，术语“无嘌呤/无嘧啶位点”、“ap位点”和“无碱基位点”可互换使用。ap位点（本文中也称为切口位点）由内切核酸酶识别，其在c’中产生1个核苷酸空位。切口位点处的切口允许随后通过链置换

bst聚合酶进行引物延伸，该聚合酶合成新的下链并最终重建功能性双链t7启动子。

12、要用于本发明的有用的切口策略和相关衔接子设计的另一个实例示于图1d中，其中使用切口限制酶变体。限制酶识别特定序列并在相对于所识别序列的限定位置处切割一条或两条链。在具体实例中，nb.bsrdi切口限制酶变体识别上链上的gcaatg序列，同时在下链中引入切口。

13、要用于本发明的有用的切口策略和相关衔接子设计的另一个实例示于图1e中，其中d10a cas9变体被用于在识别21mer的grna引导在下链中引入切口。为了使cas9酶切割grna靶向序列，必须存在与grna结合位点相邻的pam序列（此处为gg）。

14、因此，下链引物的长度以及由此产生的热稳定性为特异性重建有效连接产物的t7启动子提供了有效的选择基础，而游离衔接子单体对t7转录保持无活性，因此未能被携带用于下游的rna衔接子连接和cdna转换。衔接子二聚体可能存在另一个挑战。由于衔接子尾端的叉状结构，其不支持连接。并且由于错配聚c序列的硫代磷酸酯键，该叉状结构是耐外切核酸酶的，并且因此对常规末端修复酶具有抗性。因此，衔接子二聚体只能以头对头构型存在。在这种情况下，这些内切核酸酶可以充当限制酶，通过在顶链和下链处切口，基本上将衔接子二聚体切割成单体形式，这些单体形式在升高的温度下彼此解离，如图2所示。

15、本发明的第一方面涉及一种部分双链衔接子，其包含以下或由以下组成：具有以下通用结构的寡核苷酸：

16、5’ – a – b – c – 3’

17、3’ – a’ – b’ – c’ – 5’

18、其中

19、a)a是dna扩增序列的上链，并且a由5’–a1–a2–3’组成；

20、b) a’由3’ – a1’ – a2’ – 5’组成，并且

21、c)a1’是核苷酸序列，该序列与a1基本上非互补，其中3’末端是耐外切核酸酶的和/或含有引物延伸阻断基团；

22、d)a2和a2’不存在，或者a2和a2’是彼此基本上互补的核苷酸序列；

23、e) b和b’是5至100个脱氧核糖核苷酸范围内的彼此基本上互补的序列；以及

24、f)c和c’是彼此基本上互补的序列，其中c’包含切口内切核酸酶识别位点或切口内切核酸酶预识别位点，其中所述预切口位点可以转化为切口内切核酸酶识别位点，例如通过dna糖基化酶的作用。

25、优选地，切口内切核酸酶识别位点不是位于c’的3’末端的核糖核苷酸。

26、本发明的第二方面涉及一种部分双链衔接子，其包含以下或由以下组成：具有以下通用结构的寡核苷酸：

27、5’ – a – b – c – 3’

28、3’ – a’ – b’ – c’ – 5’

29、其中

30、a)a是dna扩增序列的上链，并且a由5’–a1–a2–3’组成；

31、b) a’由3’ – a1’ – a2’ – 5’组成，并且

32、c)a1’是核苷酸序列，该序列与a1基本上非互补，其中3’末端是耐外切核酸酶的和/或含有引物延伸阻断基团；

33、d)a2和a2’不存在，或者a2和a2’是彼此基本上互补的核苷酸序列；

34、e) b和b’是5至100个脱氧核糖核苷酸范围内的彼此基本上互补的序列；并且

35、f)c和c’是彼此基本上互补的序列，其中c’包含脱氧尿苷（du）。

36、本发明的第三方面涉及一种将一个或多个衔接子附接至一个或多个dna片段的方法，所述方法包括：

37、a)提供至少一个根据本发明的衔接子；

38、b)提供含有dna片段的样品；

39、c) 将该衔接子附接至该样品中的这些dna片段；并且

40、d) i) 如果c’包含切口内切核酸酶预识别位点，则将该样品与识别所述预切口位点的dna糖基化酶以及识别由该dna糖基化酶产生的切口内切核酸酶识别位点的切口内切核酸酶依次、部分同时或同时地在允许所述酶的活性的条件下孵育；或者

41、ii) 如果c’或-b’-c’包含切口内切核酸酶识别位点，则将该样品与识别所述切口内切核酸酶识别位点的切口内切核酸酶在允许所述酶的活性的条件下一起孵育

42、e) 将该样品在高于i) 和ii) 的tm的温度下孵育，其中i) 和ii) 如下

43、i) 5’ – c – 3’

44、3’ – c’ – 5’，

45、ii) 5’ – c – c’ – 3’

46、3’ – c’– c – 5’；

47、f)将该样品与链置换dna聚合酶一起孵育。

48、本发明的第四方面涉及一种将一个或多个衔接子附接至一个或多个dna片段的方法，所述方法包括：

49、a)提供至少一个根据本发明的衔接子，其中所述衔接子的c’包含du；

50、b)提供含有dna片段的样品；

51、c) 将该衔接子附接至该样品中的这些dna片段；并且

52、d)i) 将该样品与尿嘧啶-dna糖基化酶在允许所述酶的活性的条件下一起孵育，从而产生ap位点；

53、ii) 将该样品与识别ap位点的切口内切核酸酶在允许所述酶的活性的条件下一起孵育，其中步骤i) 和ii) 可以同时、部分同时或依次进行，

54、e) 将该样品在高于i) 和ii) 的tm的温度下孵育，其中i) 和ii) 如下

55、ii) 5’ – c – 3’

56、3’ – c’ – 5’，

57、iii) 5’ – c – c’ – 3’

58、3’ – c’– c – 5’；

59、f)将该样品与链置换dna聚合酶一起孵育。

60、应理解，在衔接子包含du的情况下，步骤(d)中由尿嘧啶-dna-糖基化酶产生的ap位点是无嘧啶位点。

61、本发明的第五方面涉及一种dna片段的扩增的方法，所述方法包括以下步骤：

62、a)通过本文所述的方法制备附接至衔接子的dna片段；

63、b)在

体外扩增所述附接至衔接子的dna片段。

64、衔接子可以添加在dna片段的一个或两个末端。可以在每个末端连接相同或不同的衔接子。在一个实施方案中，提供两种衔接子，即两种不同的衔接子，使得可以在每个末端连接不同的衔接子。这种实施方案在以下情况下特别有用：衔接子中的dna扩增序列与引物结合位点互补，并且衔接子附接的片段通过引物指导的扩增（例如通过pcr）进行扩增。特别地，在通过pcr或类似方法进行扩增的情况下，这两种衔接子种类可以包含（或提供）不同的引物结合位点。