芽孢杆菌的新型启动子变体及使用其生产蛋白质的方法与流程

相关申请的交叉引用本技术要求基于2024年4月1日提交的韩国专利申请号10-2024-0044220的优先权的权益，并且在相应韩国专利申请的文件中公开的全部内容被并入作为本说明书的一部分。在本技术中参考了许多论文和专利文献，并且指出了它们的引用。所引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本公开，以更清楚地解释本技术所属的水平和本技术的内容。本技术涉及新型芽孢杆菌(bacillus)启动子变体及使用其的蛋白质生产方法。

背景技术：

1、芽孢杆菌是一种工业微生物，可用作适合生产传统发酵食品和用于食品和药物的蛋白质的宿主。芽孢杆菌作为蛋白质生产宿主的优点包括，它是一种gras（通常被认为是安全的）微生物，对人体无害且安全，它将细胞内生物合成的蛋白质分泌到细胞外的能力优于其他微生物，并且它不产生内毒素。此外，芽孢杆菌具有完善的基因组信息、遗传操作方法和材料以及长期积累的生物学研究数据，因此容易开发用于大规模培养和生产蛋白质的宿主。使用芽孢杆菌作为宿主生产的工业酶占世界市场的一半以上，并且正在积极开发各种芽孢杆菌菌株和表达系统以增加这些酶的生产力。

2、增加微生物中蛋白质产量的最重要的步骤是目标基因的转录步骤，蛋白质产量根据启动子活性而不同。启动子位于结构基因的上游核苷酸序列中，并且当rna聚合酶与启动子区域结合的同时，启动用于制造mrna的转录。启动子的强度是决定rna聚合酶生产mrna的量的重要因素，此时，rna聚合酶与启动子结合以快速且稳定地进行转录起始的效率如何，决定了细胞内蛋白质的生产水平。也就是说，强启动子增加了宿主细胞生产的总蛋白质中目标蛋白的表达比率，并有利于目标蛋白的分离和纯化过程。因此，为了开发有效的蛋白质生产系统，确保具有强活性的启动子是必要的。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本技术的一个方面提供了一种启动子变体，其中枯草芽孢杆菌(

bacillus

subtilis)的

apre启动子的-35区被ttgaca置换，其-10区被tataat置换，所述启动子变体包含存在于-35区和-10区之间的间隔区，间隔区的长度为19 bp或17 bp，间隔区3'端的tat被tgn置换，并且n选自a、t、g或c。

3、本技术的另一个方面提供了一种表达盒，其包含前述启动子变体和目标基因。

4、本技术的另一个方面提供了一种载体，其包含前述启动子变体，或包含所述启动子变体和目标基因的表达盒。

5、本技术的另一个方面提供了一种微生物，其包含选自由所述启动子变体、包含所述启动子变体和目标基因的表达盒以及包含所述表达盒的载体组成的组中的一种或多种。所述微生物可以具有生产目标产物的能力。

6、本技术的另一个方面提供了一种生产目标产物的方法，其包括在培养基中培养前述微生物。

7、本技术的另一个方面提供了一种用于生产目标产物的组合物，所述组合物包含所述微生物、包含所述微生物的培养基或其组合。

8、本技术的另一个方面提供了前述微生物用于生产目标产物的用途。

9、[技术方案]

10、这将在下文详细描述。同时，本文公开的各个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。也就是说，本文公开的各种元素的所有组合都落入本技术的范围内。此外，本技术的范围不应被解释为受限于以下阐述的具体实施方式。

11、根据本技术的一个方面，本技术提供了一种启动子变体，其中枯草芽孢杆菌的

apre启动子的-35区被ttgaca置换，其-10区被tataat置换，所述启动子变体包含存在于-35区和-10区之间的间隔区，间隔区的长度为19 bp或17 bp，间隔区3′端的tat被tgn置换，并且n是a、t、g或c。

12、本技术的“枯草芽孢杆菌”是一种革兰氏阳性杆状细菌，也称为枯草杆菌(haybacillus)。枯草芽孢杆菌一般无致病性，广泛应用于各种工业领域，如酶生产、抗生素生产和动物饲料用益生菌。

13、在本说明书中，枯草芽孢杆菌的实例包括枯草芽孢杆菌亚种，例如枯草芽孢杆菌枯草亚种(

b. subtilis subsp.

subtilis)、枯草芽孢杆菌斯氏亚种(

b. subtilis subsp.

spizizenii)、枯草芽孢杆菌沙漠亚种(

b. subtilis subsp.

inaquosorum)等，但本技术的启动子变体的来源不限于这些实例。

14、在本说明书中，术语“启动子”是指编码区上游（5'方向）的核酸序列，其包含rna聚合酶的结合位点，并具有将下游（3'方向）目标序列转录成mrna的转录起始活性。原核生物中的启动子通常被定义为位于rna聚合酶结合的转录起始位点(tss)附近的结合位点。在本说明书中，启动子可以全部来源于天然基因，或者可以由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者可以包含合成的核酸区段。

15、原核生物中的启动子包含两个短核苷酸序列，这两个序列对于启动子活性很重要，并且通常分别位于转录起始位点上游约10 bp（碱基对）和约35 bp处。如上所述位于上游约10 bp的核苷酸序列被称为pribnow框或-10区（-10元件），并且是原核生物中起始转录所必需的序列。同时，如上所述位于上游约35 bp的核苷酸序列被称为-35元件（-35区）并且起到促进活性转录的作用。-10元件和-35元件的确切位置可以根据生物物种而不同，并且可以由于与转录调控所涉及的各种元件的复杂相互作用而受到调节。

16、在本说明书中，术语“间隔区”是指前述-35区和-10区之间的区域。原核启动子中的间隔区的长度通常为17 bp至19 bp。间隔区影响rna聚合酶的结合，并且转录效率可以根据间隔区的长度和序列而不同。间隔区的长度和序列根据特定启动子或生物物种而不同。

17、在本说明书中，术语“

apre”是指编码枯草杆菌蛋白酶的基因，枯草杆菌蛋白酶是枯草芽孢杆菌的丝氨酸碱性蛋白酶。已知

apre启动子(p

apre)受包含σ因子a (σa, sig a)的rna聚合酶调控。枯草杆菌蛋白酶也称为枯草杆菌蛋白酶e或apre。

18、在本说明书中，术语“共有序列”是指在原核启动子中的-35区、-10区或间隔区的全部或部分序列内的特定位置处特定核苷酸以高频率出现的序列。也就是说，共有序列是理论上具有代表性的核苷酸序列，是指自然界中存在的各种序列中在相应位置处出现频率最高的序列。特别地，鉴于

apre启动子依赖于rna聚合酶的σa这一事实，

apre启动子(p

apre)的共有序列可以与“siga共有序列”互换使用。

19、在本技术的一个实施方案中，与细胞的原始启动子或内源启动子相比，本技术的启动子变体可以调控（例如，增加或减少）细胞中与其可操作连接的目标基因的表达、由目标基因编码的目标蛋白的生产和/或活性、和/或目标蛋白参与生产的生物活性物质的生产和/或活性。

20、如下述实施例所示，当p

apre的-35区被保守序列ttgaca置换时，和/或当-10区被保守序列tataat置换时，p

apre的转录活性增加，从而增加了目标蛋白的表达水平。

21、在本技术的一个实施方案中，当上述间隔区3'末端的tat被tgn置换时，n可以选自a、t、g或c，例如可以是t、a或g，但不限于此。

22、如下述实施例所示，当上述间隔区3'端的tat被tgn置换时，n所代表的核苷酸可影响p

apre的转录活性。

23、在本技术的一个实施方案中，上述-35区可以位于

apre转录起始位点(tss)上游37bp或35 bp，但不限于此。

24、

apre转录起始位点(tss)是指野生型

apre的转录起始位点。具体地，-35区可以是从

apre转录起始位点上游37 bp或35 bp的位置开始，在5'至3'方向上长度为6 bp的核苷酸序列，但不限于此。

25、在一个实例中，-35区可以是从seq id no: 21的野生型p

apre的5'端第114位开始，在5'至3'方向上长度为6 bp的核苷酸序列，或者是从seq id no: 21的野生型p

apre的5'端第116位开始，在5'至3'方向上长度为6 bp的核苷酸序列，但不限于此。

26、在本技术的一个实施方案中，上述-10区可以位于

apre转录起始位点上游12 bp，但不限于此。具体地，-10区可以是从

apre转录起始位点上游12 bp的位置开始，在5'至3'方向上长度为6 bp的核苷酸序列，但不限于此。

27、在一个实例中，-10区可以是从seq id no: 21的野生型p

apre的5'端第139位开始，在5'至3'方向上长度为6 bp的核苷酸序列，但不限于此。

28、如下述实施例所示，p

apre的-35区的位置可影响p

apre的转录活性。

29、在本技术的一个实施方案中，上述启动子变体的-35区可以位于

apre转录起始位点上游37 bp，并且上述间隔区可以是长度为19 bp并且存在于-35区和-10区之间的序列，但不限于此。

30、在本技术的一个实施方案中，上述启动子变体的-35区可以位于

apre转录起始位点上游35 bp，并且上述间隔区可以是长度为17 bp并且存在于-35区和-10区之间的序列，但不限于此。

31、在本技术的一个实施方案中，所述启动子变体的-35区可以位于

apre转录起始位点上游37 bp，并且间隔区可以是其中5'端的aa序列（更具体地，位于野生型

apre转录起始位点上游30 bp和31 bp的核苷酸）从-35区和-10区之间存在的19 bp序列中缺失的序列，但不限于此。通过从19 bp序列的5'端缺失aa序列，间隔区因此可以具有17 bp的长度。

32、如下述实施例所示，p

apre的间隔区的长度可影响p

apre的转录活性。

33、在本说明书中，“启动子的转录活性”是指启动子促进下游目标序列转录的功能的定性或定量测量。测量启动子的转录活性的方法通常基于报告基因（例如，绿色荧光蛋白(gfp)）的表达，其中目的启动子序列位于报告基因（例如，gfp）的上游并与报告基因可操作地连接。例如，启动子的转录活性可以通过将目的启动子序列（或其变体（例如，包含一个或多个突变、缺失或置换））可操作地连接在报告基因（例如，gfp）的上游，并检测或测量报告基因表达的变化来测量。此外，启动子的转录活性可以通过将目标蛋白表达盒导入合适的宿主细胞（例如，芽孢杆菌属细菌）并表达目标蛋白来评估。

34、在本说明书中，术语“目标序列”可以是要表达的“目标基因”。在一个实例中，目标基因可以是编码目标蛋白的基因。目标蛋白可以是参与目标产物生产的蛋白质（例如，酶）。

35、在一个实施方案中，目标蛋白可以是丝氨酸蛋白酶，但不限于此。

36、在本说明书中，术语“目标产物”是指使用本说明书中提供的启动子变体、包含其的表达盒、表达载体和/或重组细胞（微生物）最终生产的或使其生产受到调控（增加或减少）的生物活性物质，并且例如可以指由目标基因编码的目标蛋白本身，和/或通过涉及目标蛋白而生产的任何生物活性物质。生物活性物质是指由生物体（例如，细胞）生产或来源于生物体的或在体内或细胞中具有预定功能的任何物质，并且可以是，例如，选自由以下组成的组中的一种或多种：氨基酸、氨基酸衍生物、核酸（例如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶）、核酸衍生物、维生素（例如，维生素a（视黄醇）、b（b1（硫胺素）、b2（核黄素）、b3（烟酸）、b5（泛酸）、b6（吡哆醇）、b7、b9（叶酸）、b12（钴胺素））、c（抗坏血酸）、d（钙化醇）、e（生育酚）、k（叶绿醌））、维生素衍生物、蛋白质（例如，目标蛋白以外的蛋白质，如激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白（抗体）、抗原蛋白质、受体、配体、其功能片段（具有目标功能的片段），以及其中两种或更多类型融合的融合蛋白）、糖（例如，单糖（甘油醛、二羟基丙酮、赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、脱氧核糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖）、二糖（纤维二糖、异麦芽糖、异麦芽酮糖、乳糖、乳果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松二糖）、多糖）、糖衍生物（例如，糖醇、半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸、n-乙酰葡糖胺、磺基奎诺糖(sulfoquinovose)、抗坏血酸、甘露醇、葡萄糖醛酸）、脂肪酸（例如，肉豆蔻油酸、棕榈油酸、人皮酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、芥酸、二十二碳六烯酸(dha)）、脂肪酸衍生物、有机酸（例如，乳酸、柠檬酸、草酸、尿酸、丁酸、硬脂酸、丙酸）、其代谢物（例如，聚羟基烷酸酯(pha)）、其前体及其保持生物活性的衍生物，但不限于此。

37、在一个实例中，在目标蛋白参与目标产物生产的情况下，(1)目标蛋白可以是选自由参与目标产物的细胞内生产途径（例如，生物合成、代谢、生物转化等）、细胞内转运和/或细胞外输出途径的至少一个过程或步骤的蛋白质组成的组中的至少一种，例如，合酶、裂解酶、激酶、羧化酶（例如，丙酮酸羧化酶等）、还原酶、氧化酶、脱羧酶、脱氢酶、脱水酶、转移酶、异构酶（例如，差向异构酶）等、中间产物、转运蛋白、膜蛋白（通道等）等，但不限于此，并且(2)目标基因可以是编码上述(1)中描述的目标蛋白的基因。

38、在目标产物中，氨基酸可以是蛋白氨基酸或非蛋白氨基酸。

39、蛋白氨基酸可以是选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的组中的一种或多种，也可以是其中间体。

40、蛋白氨基酸可以是选自由l-氨基酸组成的组中的一种或多种，例如，l-精氨酸、l-组氨酸、l-赖氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-天冬酰胺、l-谷氨酰胺、l-酪氨酸、l-丙氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-缬氨酸、l-苯丙氨酸、l-甲硫氨酸、l-色氨酸、l-甘氨酸、l-脯氨酸和l-半胱氨酸，或其中间体，具体地可以是l-赖氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-缬氨酸、l-精氨酸或l-谷氨酸，但不限于此。中间体可以是例如o-乙酰基高丝氨酸，其是l-甲硫氨酸的中间体，但不限于此。

41、非蛋白氨基酸可以是选自由β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(gaba)、5-氨基乙酰丙酸（δ-氨基乙酰丙酸）、对氨基苯甲酸（4-氨基苯甲酸）、α-氨基丁酸、脱氢丙氨酸、胱硫醚、羊毛硫氨酸、黎豆氨酸(djenkolic acid)、二氨基庚二酸、正缬氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、t-亮氨酸（叔亮氨酸）、α-氨基-正庚酸、哌啶酸(pipecolic acid)、α,β-二氨基丙酸、α,γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、别苏氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸（或异苏氨酸）和o-乙酰基高丝氨酸组成的组中的一种或多种，但不限于此。

42、氨基酸可以是d-氨基酸或l-氨基酸。

43、在本技术的一个实施方案中，所述启动子变体可以包含选自由下表1所示的seqid no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列，例如，选自由seq idno: 23、seq id no: 26和seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列，但不限于此。

44、[表1]

45、

46、本技术的启动子变体的核苷酸序列可以通过常规已知的诱变方法进行修饰，例如定向进化和定点诱变。也就是说，所述启动子变体可以包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：所述核苷酸序列与选自由seq id no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列具有相同或等同的生物活性，并且与选自由seq id no: 22至seqid no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列具有60%或更多、65%或更多、70%或更多、76%或更多、77%或更多、78%或更多、79%或更多、80%或更多、81%或更多、82%或更多、83%或更多、84%或更多、85%或更多、86%或更多、87%或更多、88%或更多、89%或更多、90%或更多、90.5%或更多、91%或更多、91.5%或更多、92%或更多、92.5%或更多、93%或更多、93.5%或更多、94%或更多、94.5%或更多、95%或更多、95.5%或更多、96%或更多、96.5%或更多、97%或更多、97.5%或更多、98%或更多、98.5%或更多、99%或更多、99.5%或更多、或99.9%或更多（上限可以是100%或小于100%）的同源性或同一性。此外，只要它是与选自由seq id no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列具有所述同源性或同一性，并且与选自由seq id no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列具有基本上相同或等同的生物活性的多核苷酸，具有其中部分序列缺失、修饰、置换，或者在选自由seq id no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组的任一核苷酸序列上添加了一个或多个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸也可以包括在本技术的启动子变体的范围内。

47、在一个实施方案中，seq id no: 21的野生型p

apre可以是紧邻野生型

apre转录起始位点的上游序列，但不限于此。

48、在本说明书中，术语“同源性”或“同一性”是指与给定核酸序列或氨基酸序列的对应程度，并且可以用百分比(%)表示。例如，同源性可以通过比对序列信息并使用容易获得的计算机程序直接比较两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的参数（如得分、同一性和相似性）来确定。计算机程序可以是blast (ncbi)、clc main workbench (clc bio)、megaligntm (dnastar inc.)等。

49、在一个具体实施方案中，包含本说明书中提供的特定核苷酸序列的启动子变体可以解释为不仅包含该特定核苷酸序列或与其基本上等同的核苷酸序列，还包含包含与该特定核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸片段。具体地，具有这种互补性的多核苷酸可以与该特定核苷酸序列在可由本领域技术人员根据目的进行适当调整的tm值下杂交，例如，tm值为55℃、60℃、63℃或65℃，并且可以在下述条件下进行分析：这些条件在已知文献中有具体描述。例如，所述条件可以包括具有高度互补性，如60%或更多、70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、98%或更多、99.5%或更多、或99.9%或更多的互补性的多核苷酸彼此杂交，而具有更低互补程度的多核苷酸彼此不杂交的条件。所述条件还可以包括普通的southern杂交洗涤条件，包括在对应于60℃、1× ssc（盐水-柠檬酸钠缓冲液）和0.1% (w/v) sds（十二烷基硫酸钠）；60℃、0.1× ssc和0.1% sds；或68℃、0.1× ssc和0.1% sds的盐浓度和温度下洗涤一次，或者特别是两次至三次，但不限于此。杂交要求两个核苷酸具有互补序列，但是根据杂交的严格性，碱基之间的错配可能是允许的。术语“互补”可用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，在dna的情况下，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，这在相关领域是熟知的（参见sambrook等人, 上文, 9.50-9.51, 11.7-11.8）。

50、根据一个具体实施方案，所述启动子变体可以包含选自由seq id no: 22至seqid no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列，并且可以由或基本上由选自由seqid no: 22至seq id no: 28的核苷酸序列组成的组中的任一核苷酸序列组成。

51、在本技术的一个实施方案中，所述启动子变体可以是分离的。如本文所用，“分离”或“纯化”是指生物分子（例如，多肽或多核苷酸）通过从一些或所有在自然界中与其相关联的天然存在的组分分离而改变了其天然状态。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术实现，如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他盐沉淀方法、离心、尺寸排阻层析、过滤、微滤、凝胶电泳或梯度分离，以从最终组合物中去除不需要的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。还可以向纯化或分离的生物分子组合物中添加提供额外益处的组分，如活化剂、抵消抑制剂的试剂、所需离子、用于控制ph的化合物或其他酶或化学品。

52、根据本技术的另一方面，本技术提供了包含本技术的启动子变体和目标基因的表达盒。

53、目标基因可以是编码目标蛋白的基因，目标蛋白可以是参与目标产物生产的蛋白质（例如，酶）。

54、目标产物可以是选自由氨基酸、氨基酸衍生物、核酸、核酸衍生物、维生素、维生素衍生物、糖、糖衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、蛋白质和其他代谢物组成的组中的一种或多种。

55、在本说明书中，术语“表达盒”可以指构建体，其是能够在宿主细胞中表达的核酸片段的最小单位，并且可以至少包含目标基因和表达调控序列（例如，启动子）。

56、所述启动子变体可以包含在目标基因的5'末端或3'末端区域。

57、所述启动子变体可以与目标基因可操作地连接。

58、所述启动子变体、目标基因、目标蛋白和目标产物如上所述。

59、根据本技术的另一方面，本技术提供了包含前述启动子变体或表达盒的载体。

60、在本说明书中，术语“载体”是指能够在合适的宿主细胞（微生物）中表达目标蛋白的表达载体，并且是指包含与基因插入物可操作地连接的必需调控元件的基因构建体，使得基因插入物（表达盒）可以表达。本技术的表达载体没有特别的限制，只要它能在宿主细胞（微生物）中复制，并且可以选自任何通常使用的载体。通常使用的载体的实例包括但不限于天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为载体，pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a或charon21a可以作为噬菌体载体或粘粒载体使用，基于pbr、基于puc、基于pbluescriptii、基于pgem、基于ptz、基于pcl或基于pet的载体可以作为质粒载体使用。具体地，可以例举pdg1730、pdz、pacyc177、pacyc184、pcl、peccg117、puc19、pbr322、pmw118或pcc1bac载体，但不限于此。

61、在本说明书中，术语“调控元件”是指帮助或影响编码蛋白质的核酸序列的转录、翻译或表达增强的非翻译核酸序列。本技术的表达载体必须包含本技术的启动子变体作为调控元件，并且可以包含能够影响蛋白质表达的表达调控序列，例如，起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、增强子、用于膜靶向或分泌的信号序列等。

62、在本技术的一个实施方案中，前述载体可以另外包含前述启动子变体序列下游的编码目标蛋白的基因，并且编码目标蛋白的基因可以与前述启动子变体可操作地连接。

63、在本说明书中，“可操作地连接”是指前述启动子变体与编码目标蛋白的基因的核苷酸序列功能性地连接，从而启动和/或介导编码目标蛋白的基因的转录。可操作的连接可以使用本领域已知的遗传重组技术进行，例如位点特异性dna切割和/或连接技术，位点特异性dna切割和连接可以使用常规切割酶和/或连接酶等进行，但不限于此。

64、在本说明书中，术语“目标蛋白”是指使用本技术的启动子变体增加表达的任何蛋白，并且可以是同源或异源的。

65、在本说明书中，术语“基因”是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸，其包括蛋白质编码序列的全部或部分，并且可以包括例如调控（非转录）dna序列，如决定基因表达条件的启动子序列。

66、在本技术的一个实施方案中，包含前述启动子变体的载体可以另外包含用于蛋白质纯化的标签。用于蛋白质纯化的标签不受限制，只要它促进本技术中回收的目标蛋白的纯化，其实例包括谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia, usa)、麦芽糖结合蛋白(neb, usa)、flag(ibi, usa)和6x his (六聚组氨酸; qiagen, usa)。

67、在本技术的一个实施方案中，包含前述启动子变体的载体还可以包含用于确认整合到宿主细胞（微生物）染色体中的选择标记。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即用于确认本技术的启动子变体的核苷酸序列是否已经插入，并且可以选自由赋予可选择表型（如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白表达）的基因组成的组。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞存活或表现出不同的表型性状，因此可以选择转化的细胞。

68、根据本技术的另一方面，本技术提供了宿主细胞或重组细胞，其包含选自由本技术的前述启动子变体、启动子变体和与其可操作地连接的目标基因、表达盒和载体组成的组中的至少一种。

69、所述启动子变体、目标基因、表达盒或载体如上所述。

70、在本说明书中，术语“重组细胞”可以指导入了多核苷酸和/或重组载体的转化体。术语“转化”是指将目标核酸（dna或rna）导入宿主细胞（微生物）以改变宿主细胞（微生物）的遗传性状。可以根据宿主细胞，通过选择本领域已知的合适的标准技术来实施转化方法。例如，转化包括但不限于电穿孔、脂质转染、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法和乙酸锂-dmso法。

71、宿主细胞不受特别限制，只要本技术提供的多核苷酸作为启动子起作用，使与其可操作地连接的目标基因能够（或增加）表达，其中目标基因可以是重组载体中包含的基因或宿主细胞的内源基因。

72、在一个实例中，宿主细胞可以是微生物、植物细胞或动物细胞。

73、本技术的微生物可以是具有生产目标产物的能力或具有提高的生产目标产物的能力的微生物。

74、本技术的微生物可以是这样的微生物，其中通过将选自由启动子变体、表达盒和载体组成的组中的一种或多种导入天然缺乏生产目标产物的能力的微生物，或具有生产目标产物的能力的微生物，而被赋予或提高生产目标产物的能力，但不限于此。

75、所述微生物具有提高的生产目标产物的能力或具有生产目标产物的能力可以意味着所述微生物与未修饰的微生物、重组前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株相比，具有提高的生产目标产物的能力，或者所述微生物与未修饰的微生物、重组前的细胞、亲本菌株和/或野生型菌株（其中各自都缺乏生产目标产物的能力）不同，被赋予生产目标产物的能力。

76、导入了选自由启动子变体、表达盒和载体组成的组中的一种或多种的微生物可以与导入前的微生物或这种增强前的微生物（即相同物种的未修饰的微生物）相比具有提高的生产目标产物的能力。在本技术中，“未修饰的微生物”不排除具有可能在微生物中天然发生的突变的微生物，并且可以指野生型微生物或天然存在的微生物本身，或者其性状由于天然或人工因素的遗传变异而改变之前的微生物。例如，未修饰的微生物可以指尚未导入选自由启动子变体、表达盒和载体组成的组中的一种或多种的菌株，或这种导入前的菌株。“未修饰的微生物”可以与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“未突变的菌株”、“未修饰的菌株”、“未突变的微生物”或“参考微生物”互换使用。所述启动子变体、表达盒和载体如上所述。

77、在本技术的一个实施方案中，其中已经导入了选自由启动子变体、表达盒和载体组成的组中的至少一种的微生物可以与突变前的亲本菌株、未修饰的微生物、亲本菌株或野生型微生物相比具有新赋予的或增加的生产目标产物的能力，但不限于此。

78、作为另一个实例，具有提高的生产目标产物的能力的微生物可以与突变前的亲本菌株或未修饰的微生物相比具有约2倍或更多、约10倍或更多、约50倍或更多、约80倍或更多、约95倍或更多、约100倍或更多、约110倍或更多、约120倍或更多、约130倍或更多、约140倍或更多、约150倍或更多、约160倍或更多、约175倍或更多、约200倍或更多、约230倍或更多、约250倍或更多、约280倍或更多（上限没有特别限制，并且例如可以为约1,000倍或更少）的生产目标产物能力，但不限于此。

79、术语“约”涵盖±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范围，并且包括与术语“约”后面的数值等同或相似的所有数值，但不限于此。

80、在本技术的一个实施方案中，可以分离如上所述的本技术的宿主细胞。

81、作为可以稳定、连续地克隆和表达本技术的载体的宿主细胞或细胞系，可以使用本领域已知的任何宿主细胞，其实例包括芽孢杆菌属菌株，如枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(

bacillus thuringiensis)；肠杆菌菌株(enterobacterial strain)，如鼠伤寒沙门氏菌(

salmonella typhimurium)和粘质沙雷氏菌(

serratia marcescens)；各种假单胞菌属(pseudomonas)物种；以及大肠杆菌(

e. coli)菌株，如大肠杆菌origami2、大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x 1776和大肠杆菌w3110，但不限于此。

82、在本技术的一个实施方案中，如上所述的宿主细胞可以是革兰氏阳性菌。

83、在本技术的一个实施方案中，革兰氏阳性菌可以是选自由以下组成的组的革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(

bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(

bacillus megaterium)、蜡样芽孢杆菌(

bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌、短芽孢杆菌(

bacillus brevis)以及乳杆菌属(

lactobacillus)或类芽孢杆菌属(

paenibacillus)的细菌，但不限于此。

84、在本说明书中，“转化”或“转染”是指将基因导入宿主细胞，使得该基因可以在其中表达。用导入了目标基因的载体转化或转染宿主细胞的方法包括将核酸导入细胞的任何方法，并且可以通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行。

85、用于将本技术的载体递送到宿主细胞中的方法包括cacl2沉淀法、hanahan法（其通过在cacl2法中使用还原性物质dmso（二甲基亚砜）来提高效率）、电穿孔、磷酸钙沉淀法、原生质体融合、使用碳化硅纤维的搅拌法、土壤杆菌属(agrobacterium)介导的转化、聚乙二醇(peg)介导的转化，以及由硫酸葡聚糖、lipofectamine和干燥/抑制介导的转化方法。用本技术的载体转化或转染宿主细胞的方法不限于上述实例，可以使用本领域通常使用的方法而没有限制。

86、根据本技术的另一方面，本技术提供了一种用于生产目标产物的组合物，其包含所述微生物、培养所述微生物的培养基或其组合。

87、所述组合物还可以包含用于生产目标产物的组合物中通常使用的任何合适的赋形剂，这种赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。

88、根据本技术的另一方面，本技术提供了前述微生物用于生产目标产物的用途。

89、根据本技术的另一方面，本技术提供了前述微生物用于制备用于生产目标产物的组合物的用途。

90、根据本技术的另一方面，本技术提供了一种生产目标产物的方法，其包括在培养基中培养前述微生物。

91、所述方法还可以包括在培养后从培养基或微生物中回收目标产物。

92、培养微生物的培养基可以包含或不包含微生物。

93、如上所述，所述微生物可以包含选自由以下组成的组中的一种或多种：本技术中提供的多核苷酸；包含所述多核苷酸和目标基因的表达盒；和包含所述表达盒的载体。

94、在本说明书中，“培养”是指在人工控制的环境条件下使细胞生长。本说明书中提供的生产目标产物的方法可以通过适当选自本领域广泛已知的所有方法的手段来进行。例如，培养可以以分批过程、补料分批过程或重复补料分批过程进行，但不限于此。用于培养的培养基可以是以适当方式满足待培养细胞的生长要求的培养基。

95、在本技术中，“培养基”是指其中混合了培养微生物所需的营养物作为主要成分的物质，并且它提供营养物和生长因子等，包括生存和生长所必需的水。具体地，可以使用用于培养本技术的微生物的任何培养基和其他培养条件而没有特别限制，只要它是常规用于培养微生物的培养基；然而，本技术的微生物可以在有氧条件下，在含有合适的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的普通培养基中，同时控制温度、ph等的条件下培养。

96、用于培养或包含在培养基中的碳源可以包括选自由以下组成的组中的一种或多种：糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；以及有机酸，如乙酸，但不限于此。用于培养或包含在培养基中的氮源可以包括选自由以下组成的组中的一种或多种：有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，以及无机氮源，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，但不限于此。用于培养或包含在培养基中的磷源可以包括选自由以下组成的组中的一种或多种：磷酸的钾盐，如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，及其相应的钠盐，但不限于此。此外，培养基可以含有生长所需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，除了上述之外，还可以在培养中或培养基中额外使用或包含选自必需生长物质如氨基酸和维生素的一种或多种。此外，培养基可以包含目标产物的适当前体作为原料。前述原料可以在培养过程中通过合适的方法以分批和/或连续的方式添加到培养物中。

97、在细胞培养过程中，可以通过以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，和/或酸性化合物如磷酸或硫酸来调节培养物的ph。此外，在培养过程中，可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制起泡。此外，为了保持有氧状态，可以将氧气或含氧气体（例如，空气）注入培养物中。培养基和/或培养物的温度通常可以为20℃至45℃，或25℃至40℃。培养可持续至目标产物的产量达到所需量，例如，可以为约10至约160小时，但不限于此。

98、从培养的微生物或培养基中分离或回收目标物质可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法进行。例如，可以使用诸如离心、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解（例如，硫酸铵沉淀）和/或层析（例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析和尺寸排阻层析）的方法，但不限于此。培养基是指已经在其中培养了重组细胞的培养基。

99、根据一个实施方案，分离或回收目标产物可以包括通过低速离心培养物来去除生物质，并通过离子交换层析来分离获得的上清液。

100、生产目标产物的方法还可以包括纯化目标产物的过程。

101、从培养物（培养基）中回收目标产物可以通过使用本领域已知的常规手段的分离方法来进行。可用于分离目标产物的常规手段的实例包括离心、过滤、层析和/或结晶法。在一个实例中，通过低速离心培养物来去除生物质，并对获得的上清液进行离子交换层析以分离目标产物，但不限于此。回收还可以包括纯化过程。

102、根据本技术的另一方面，本技术提供了选自由上述本技术的启动子变体；包含启动子变体的载体；以及包含启动子变体和/或包含启动子变体的载体的微生物组成的组中一种或多种用于生产目标产物，和/或制造生产目标产物的微生物，和/或赋予和/或增加微生物生产目标产物的能力的用途。

103、在用于生产目标产物，和/或制造生产目标产物的微生物，和/或赋予和/或增加微生物生产目标产物的能力的用途中，所述启动子变体、载体和微生物等如上述其他方面所述；因此，其共同的描述通过引用结合于此，并且省略其详细描述以避免本说明书的过度复杂。

104、根据本技术的另一方面，本技术提供了以本技术中公开的一种或多种元素为特征的组合物、方法、产物、过程或用途。