用于防止在人多能干细胞的分化过程中产生不需要的细胞的方法与流程

本发明总体上涉及干细胞领域。特别地，本发明涉及一种用于防止在人多能干细胞(hpsc)分化为定形内胚层(de)或神经元或非胰腺内胚层或胰腺腺泡细胞或导管上皮的过程中产生特定类型的不需要的细胞的方法。序列表通过引用并入序列表本技术与序列表一起以电子格式提交。序列表的全部内容特此通过引用并入。

背景技术：

1、人多能干细胞(hpsc)可以无限复制，同时保留分化为人体的所有细胞类型的能力。一种这样的细胞类型是胰腺内分泌细胞(pec)，包括产生胰岛素的β细胞。进行hpsc的逐步体外分化以获得pec的取之不尽的来源，pec正被探索作为用于治疗糖尿病的可移植干细胞治疗产品。

2、然而，使用pec或从hpsc分化的其他细胞类型作为细胞治疗产品的主要障碍是由于被不需要的细胞污染而导致的潜在安全风险。一种类型的不需要的细胞是残留的(未分化的) hpsc，其可能由于分化效率低下而保留。另一种类型的不需要的细胞是在hpsc分化的早期阶段期间由一个或多个不同的胚层：外胚层、中胚层和内胚层产生的一种或多种脱靶细胞群体。在所有胚层中出现的一种这样的脱靶细胞群体：来自体外分化方案的中脑腹侧神经谱系(外胚层)、心肌细胞(中胚层)和胰岛谱系(内胚层)的细胞并且促成异质混合物，是基质或成纤维细胞身份的细胞类型。基质细胞被发现是异源hpsc衍生的分化方案的常见组分，并且被认为是不合需要的细胞类型。其他类型的脱靶细胞群体是非胰腺内胚层或胰腺腺泡细胞或导管上皮。

3、另一种脱靶细胞群体是在hpsc分化为pec的过程中产生的中胚层细胞群体。第一步是诱导称为原条(ps)的中间细胞群体，其随后可分叉为合乎需要的定形内胚层(de)或不需要的中胚层脱靶细胞群体。

4、已经进行了若干尝试来减少中胚层脱靶细胞群体，诸如通过经由细胞分选进行的富集或药理学抑制来减少中胚层来源的谱系。

5、cuesta-gomez等人(cell reports 40，2022年8月23日)公开了富集内分泌群体和去除脱靶细胞的最新方法。

6、然而，控制谱系特异性分化(特别是在初始内胚层和中胚层分叉期间)仍然是一个挑战，特别是当按比例扩大分化方案时。

7、由于hpsc分化效率低下，可能发生de的不完全诱导，从而导致不需要的残留hpsc。pec被残留的hpsc污染可导致在pec移植到受试者体内时形成畸胎瘤。一些策略致力于检测和消除旨在用于临床用途的干细胞来源的产品中的残留hpsc。

8、aghazadeh等人(stem cell reports，第17卷，964-978，2022年4月12日)公开，富含gp2的胰腺祖细胞在体内产生功能性胰岛素产生细胞并消除畸胎瘤形成的风险。

9、然而，仍然需要更有效的策略和方法来防止在hpsc体外分化为de (其可以随后分化以获得pec)过程中或在hpsc体外分化为分化的细胞(诸如神经元或非胰腺内胚层或胰腺腺泡细胞或导管上皮)过程中的残留hpsc和/或中胚层脱靶细胞群体形成。还仍然需要不含或具有显著减少数量的脱靶细胞如中胚层细胞和/或残留hpsc的细胞治疗产品。这种细胞治疗产品可以用于治疗糖尿病以及其他疾病。

技术实现思路

1、本发明涉及用于抑制或减少在hpsc分化为de或hpsc分化为神经元或非胰腺内胚层或胰腺腺泡细胞或导管上皮过程中产生的不需要的细胞的体外方法。

2、在一个方面，本发明提供了一种用于抑制或减少在hpsc体外分化为de过程中的中胚层细胞群体形成的方法，所述方法包括使所述hpsc中的一种或多种基因失活或降低所述一种或多种基因的表达，其中所述一种或多种基因是所述中胚层细胞群体形成所需的。

3、在另一个方面，本发明提供了一种用于抑制或减少在hpsc体外分化为de过程中的中胚层细胞群体形成的方法，所述方法包括使所述hpsc中的一种或多种基因失活或降低所述一种或多种基因的表达，其中所述中胚层细胞群体形成所需的所述一种或多种基因选自mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1。

4、在一个方面，本发明提供了一种用于使hpsc分化为de的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述hpsc的步骤，其中所述hpsc中中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活。

5、在另一个方面，本发明提供了一种用于使hpsc分化为de的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述hpsc的步骤，其中所述hpsc中选自mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1的中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活。

6、在一个方面，本发明提供了一种用于使hpsc分化为de的方法，所述方法包括在包含wnt信号传导激活剂的细胞培养基中培养所述hpsc的步骤，其中所述hpsc中中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活。

7、在另一个方面，本发明提供了一种用于使hpsc分化为de的方法，所述方法包括在包含wnt信号传导激活剂的细胞培养基中培养所述hpsc的步骤，其中所述hpsc中选自mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1的中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活。

8、在一个方面，本发明提供了一种或多种遗传工程化细胞或其细胞群体，其中所述一种或多种细胞包含以下中的一者或多者或由以下中的一者或多者组成：已经失活或具有降低的表达的mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1基因。

9、在另一个方面，本发明提供了一种或多种遗传工程化细胞或其细胞群体，其中所述一种或多种细胞经遗传修饰以防止在人多能干细胞分化为定形内胚层、胰腺内胚层或胰腺内分泌细胞过程中的中胚层细胞形成，其中所述遗传工程化细胞包含以下中的一者或多者或由以下中的一者或多者组成：已经失活或具有降低的表达的mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1基因。

10、在另一个方面，本发明提供了一种来源于人多能干细胞的根据前述方面的遗传工程化细胞或定形内胚层的体外细胞群体，其中所述人多能干细胞中中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活，其中所述一种或多种基因选自mesp1、mesp2、tbx6、hes7、cdx1、cdx2、cdx4、tbxt、hoxa1、hoxb1、hoxb3、hoxb4、msx1、msx2、msgn1、etv1、evx1、hand1、hand2、sox7、foxf1、foxc1、foxc2、rspo3、arl4d、aplnr、nedd9、nts或lef1。

11、在另一方面，本发明提供了一种来源于hpsc的遗传工程化细胞或de的细胞群体，其中所述细胞群体包含少于1%或2%的中胚层细胞和/或少于0.05%的hpsc。这意味着在由hpsc分化为de产生的细胞群体中，所述细胞群体中所含的少于1%的细胞是中胚层细胞，或者所述细胞群体中所含的少于2%的细胞是中胚层细胞，并且/或者所述细胞群体中所含的少于0.05%的细胞是残留的hpsc。

12、在一个方面，本发明提供了一种细胞组合物，其包含细胞培养基和来源于hpsc(其中中胚层细胞群体形成所需的一种或多种基因已经失活)的遗传工程化细胞或de细胞群体，所述细胞群体用于进一步分化或分化为pec或胰岛素产生细胞，所述pec或胰岛素产生细胞通过将所述pec或所述胰岛素产生细胞或源自所述pec或所述胰岛素产生细胞的组织或器官施用或移植或植入到受试者体内而用作治疗糖尿病的药物。

13、本发明还可解决从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其他问题。